一种白金针菇菌包工厂标准化生产配套新品种选育方法
【专利摘要】一种白金针菇菌包工厂标准化生产配套新品种选育方法。发明属于食用菌栽培学【技术领域】，涉及怎样在人工条件下培育白金针菇新品种的方法，通过收集国内栽培白金针菇菌株，通过菌株纯化、拮抗试验和分子生物学实验对其进行亲缘关系比较，并在此基础上进行菌包工厂化生产发菌试验，构建小型核心种质库，对筛选出各方面优良的菌株进行原生质体融合杂交等实验，筛选并最终选育出生产能力旺盛、生物转化率高的新品种，并进行各级菌种培养和出菇实验，优化新菌种的培养条件并对其进行生物学特征分析，为白金针菇的进一步推广开发研究提供新的优质高产菌种。
【专利说明】一种白金针菇菌包工厂标准化生产配套新品种选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食用菌栽培学【技术领域】，涉及怎样在人工条件下培育白金针菇新品种 的方法。
【背景技术】
[0002] 金针燕学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火燕、构菌、朴燕、冬燕、朴菰、冻菌、金燕、智 力燕等，英文为：〃ENIKI MUSHROOM〃，学名为/?遞因其菌柄细长，似金 针菜，故称金针菇，属伞菌目白蘑科金针菇属。
[0003] 金针菇在自然界广为分布，中国、日本、俄罗斯、欧洲、北美洲、澳大利亚等地均有 分布。在中国北起黑龙江，南至云南，东起江苏，西至新疆均适合金针菇的生长。金针菇不 含叶绿素，不具有光合作用，不能制造碳水化合物，完全可在黑暗环境中生长，必须从培养 基中吸收现成的有机物质，如碳水化合物、蛋白质和脂肪的降解物，为腐生营养型，是一种 异养生物，属担子菌类。金针菇是一种木材腐生菌，易生长在柳、榆、白杨树等阔叶树的枯树 干及树桩上。金针菇是秋冬与早春栽培的食用菌，以其菌盖滑嫩、柄脆、营养丰富、味美适口 而著称于世。据测定，金针菇氨基酸的含量非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量 特别高，赖氨酸具有促进儿童智力发育的功能。金针菇干品中含蛋白质8. 87%，碳水化合物 60. 2%，粗纤维达7. 4%，经常食用可防治溃疡病。最近研究又表明，金针菇内所含的一种物质 具有很好的抗癌作用。金针菇既是一种美味食品，又是较好的保健食品，金针菇的国内外市 场日益广阔。金针菇人工栽培技术并不复杂，只要能控制好环境条件，就容易获得稳定可靠 的产量。在作为食材时，金针菇特别是凉拌菜和火锅的上好食材，其营养丰富，清香扑鼻而 且味道鲜美，深受大众的喜爱。
[0004] 虽然金针菇营养保健价值高，但国内对金针菇的研究起步较晚，尤其白金针菇菌 包工厂标准化生产优良品种选育和高产优质生产工艺的研究，更是近几年才刚刚开始。有 关金针菇的研究上世纪末本世纪初才逐渐开始，且主要停留在对金针菇的野生驯化、生物 学特性及人工栽培技术等方面。近年来，我国和日本已对金针菇的人工驯化新品种进行了 研究，但由于对金针菇的生物学特性了解不够完善，人工栽培子实体，生产周期长，产量 低，因而未得到全面开发，目前金针菇在日本和我国非常畅销，而且价格较高。随着人们对 金针菇食（药）用价值认识的逐步深入，许多食品及药品行业对其需求也越来越大，但受 现在金针菇新品种的影响，金针菇的种植利润价值一直很高，因此有着广阔的发展前景。
【发明内容】
[0005] -、试验菌株资源收集与整理 菌种资源是新品种选育的基石，是资源创新利用的基础。我们已经收集了国内外的人 工生产白金针菇菌株20种。已分别进行了菌株的来源、种类、生物学特征、分类地位、分子 标记（ITS序列信息）的材料档案，并已建立了从白金针菇子实体分离和保存菌种的操作规 程和方法体系，保证了我们可以源源不断地收集和提纯复壮白金针菇。
[0006] 考虑国内金针菇菌株品种混乱，同种异名，异种同名现象普遍，我们采用常规的拮 抗实验、分子生物学实验进行排除。
[0007] 1.菌株菌丝形态观察 选取菌株生长旺盛的菌株进行试验。
[0008] 2.菌株保守性ERIC分子鉴定技术（图1) 2. 1 PDA液体培养基。
[0009] 2. 2基因组总DNA提取采用2 X CTAB。
[0010] 取〇. 2g液氮研磨的真菌粉末，放入1. 5mL以灭菌的EP管，加入600uL已65°C预热 的2 X CTAB提取液，再加入1. 2uL的巯基乙醇，充分混匀。65°C水浴45min，期间定期晃动混 匀。将EP管从水浴中拿出，室温冷却后，再在该EP管中加入600uL的氯仿：异戊醇（24:1)， 振荡混勻5-10min。8000r/min离心lOmin，取上清。重复抽提两次。加0. 8倍体积的冷的 异丙醇，混匀，-20°C放置15-30min。10000r/min离心8min去沉淀，70%乙醇清洗2次，风 干。加 100uLTE(pH8. 0)溶解。加入 2uLRNaseA(10mg/ml)，37°C温箱中 30min。加等体积氯 仿：异戊醇（24 :1)，振荡混匀，10000r/min离心lOmin取上清。加入2倍的冷的无水乙醇 和 1/10 的 3MNaAC，-20°C放置 15-30min。10000r/min 离心 lOmin。取沉淀，70% 乙醇清洗 2 次，风干，加20uLTE(pH8. 0)溶解，4°C保存。
[0011] 2.2 ERIC 分子鉴定 通过ERIC分子标记技术，剔除掉相互间异名同种的白金针菇菌菌株，保留下相互间有 差异的白金菇菌株。最后，白金针菇菌种资源来源，如下表所示： 表1白金针菇菌株来源 Table 1 Sources of Flammulina velutipes
【权利要求】
1. 种细胞质融合在白金针菇菌包工厂标准化生产中的育种技术，其特征在于该新品种 通过两个菌株细胞质体融合成杂交合体。
2. 具体工艺步骤为： 供试菌株的菌丝体液体培养 原生质体的制备 原生质体的形成 原生质体的融合 融合的原生质体再生 融合子的筛选 优良融合子的鉴定 白金针菇菌包工厂标准化生产。
3. 根据权利要求1 一种细胞质融合在白金针燕菌包工厂标准化生产中的育种技术所 述，其步骤2特征在于包括：配制稳渗剂，并用针孔过滤器过滤除菌；将-20 °C冰箱中保存 的溶壁酶称取〇. 05 g的溶壁酶至无菌5 ml的EP管中，并用过滤除菌的稳渗剂稀释并加入 5 μ 1氯霉素溶液除菌，待用；去25 °C下培养5天的2个金针菇菌株菌丝体取出并用稳渗 剂清洗两次；将清洗后的白金针菇菌丝体转至盛有溶壁酶液的EP管中，并用封口膜封口， 剧烈震荡使菌丝体破裂便于消化； 将EP管置于30°C的恒温振荡培养箱中消化，每半小时取0. 1 ml的酶液观察并计数，直 至原生质体数量开始下降，最后一次计数的时间减去半小时即为最佳消化时间；将最佳消 化时间内消化的酶液用四层的擦镜纸过滤两次(注意过滤次数不宜过多，否则收集到的原 生质体数量将受到明显影响)，离心收集菌体，并用稳渗剂调整菌体浓度至1X l〇7r/ml，计 算获得的原生质体比例，三次计数取平均值。
4. 根据权利要求1 一种细胞质融合在白金针燕菌包工厂标准化生产中的育种技术所 述，其步骤3特征在于用不同的溶液作为渗透压稳定剂，以蒸馏水作为对照，在相同条件 下，用溶壁酶进行作用，结果如表1所示。表1稳渗剂对原生质体得率的影响
经上表我们可以看出0. 6M的KC1溶液和MgS04溶液做稳渗剂效果较好，但在观察中发 现利用MgS04溶液做稳渗剂得到的原生质体在4°C的冰箱中保存两天后细胞破裂严重，所以 本实验中采用KC1做稳渗剂。
5. 根据权利要求1 一种细胞质融合在白金针燕菌包工厂标准化生产中的育种技术所 述，其步骤5的特征在于与酵母菌等低等真菌不同，白金针菇属于高等真菌，在进行原生质 体再生时的再生比例一般低于5%，因此取稀释浓度为1000col/ml的原生质体悬浊液0. lml 进行复壁培养并进行五次计数取平均值，以降低因菌体未混匀带来的偶然性。
6. 根据权利要求1 一种细胞质融合在白金针燕菌包工厂标准化生产中的育种技术 所述，其步骤8特征在于包括：拌料一打包一灭菌一接菌一:1?养（18 -20°C )-催雷（13- 15°C)-出菇(冷库4-8°C)-采收一包装一运输销售。
【文档编号】C12N15/04GK104250644SQ201310221260
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2013年6月3日
【发明者】蔡德华 申请人:鲁东大学