一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，包含OneStepRT-PCRbufferIII、ExTaqHS、PrimerScriptRTEnzymeMixII、阴性对照、阳性对照、以及序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。本发明将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间缩短，有利于快速检测。本发明还使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增靶序列上时才会产生有效的结果，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于CSFV的防控和隐性带毒动物的剔除。
【专利说明】—种用于检测猪瘍病毒的Taqman Real-time RT-PCFHii1J
合
Si
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪瘟病毒防治【技术领域】，具体说是一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR (探针法实时定量反转录-聚合酶链反应)试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002]古典猪痕(Classical swine fever, CSF)简称猪痕,是由猪痕病毒(Classicalswine fever virus, CSFV)引起猪的急性、烈性、接触性传染病,我国是猪痕严重的流行国家之一，每年因猪瘟造成的直接经济损失有数十亿元，严重威胁我国养猪业及其国际贸易的发展。以前采取接种猪瘟兔化弱毒疫苗的方法来预防和控制猪瘟的流行，成功的控制了猪瘟的大爆发。然而，猪瘟的流行特点却从大流行转变为地方性流行和散发，并且不分季节的随时发生。临床特点也从典型猪瘟转变为非典型性猪瘟，诊断和预防难度越来越大，因此猪瘟仍是威胁养猪户的头号传染病。目前，国外和国内均已建立了 RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)检测方法。国外应用PCR诊断CSFV已取得很大进展，许多学者根据CSFV序列，设计了不同引物，建立了检测CSFV核酸的普通RT-PCR方法、套式RT-PCR方法及复合式RT-PCR方法等。该方法直接从猪的脾脏、全血、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片断，但是上述方法耗时长，扩增结束后还需要进行电泳才能观察结果，检测一份样品需耗时7小时左右。同时CSFV是一种高度传染性的病毒，其RNA (核糖核酸)特别容易发生变异，现有的检测方法不具有快速，敏感和准确的特点，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格便宜的CSFV检测试剂盒。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确地检测病毒的一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒,本发明还提供该试剂盒的使用方法。
[0004]为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案:
一种用于检测猪痕病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含PrimerScript RT Enzyme Mix II (反转录酶混合液)、One Step RT-PCR bufferlll (一步反转录-聚合酶链反应缓冲液)、Ex Taq HS (具有校正功能耐热脱氧核糖核酸聚合酶)、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 2的扩增引物和序列SEQ ID NO: 3的探针引物的混合物。
[0005]所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:2为:
SEQ ID NO:1:上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGC，
SEQ ID NO: 2:下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
[0006]所述针引物序列为:SEQ ID NO:3:AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCGo
[0007]所述扩增弓丨物扩增出的条带序列为:
SEQ ID NO:4 (274 bp):
【权利要求】
1.一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，包含One Step RT-PCRbufferlll、Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix I1、阴性对照，其特征在于:还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO:1 M SEQ ID NO: 2的扩增引物和序列SEQ ID NO: 3的探针引物的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:2为:
SEQ ID NO:1:上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGC， SEQ ID N0:2:下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物序列为:
SEQ ID NO:3:AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCGo
4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID N0:1M SEQ ID NO: 2的扩增引物和序列SEQ ID NO: 3的探针引物浓度均为lOpmol/yL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。
5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述扩增引物扩增出的条带序列为: 序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延长的序列；
SEQ ID NO:4 (274 bp):
6.根据权利要求1或3所述的一种用于检测猪痕病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物的5’端标记物为FAM报告荧光基团、3’端标记物为TAMRA淬灭荧光基团。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pMD-274阳性质粒，该质粒是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所扩增的猪瘟病毒基因序列，长度274bp，克隆至pMD-18T克隆载体，命名为pMD-274。
8.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒组分的配比为:
a.2XOne Step RT-PCR bufferlll:25 份；
b.Ex Taq HS:1 份；
c.PrimerScript RT Enzyme Mix I1:1 份； d.引物浓度均为lOpmol/μI的三条引物混合液6份，274bp上游引物2份，274bp下游引物2份，探针引物2份； e.无RNA酶水13份； f.阳性对照pMD-274阳性质粒6份； g.阴性对照无RNA酶水6份。
9.一种如权利要求1所述用于检测猪痕病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤: a.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增,条件如下:42°C反转录5min；94°C预变性 2min; 94°C 20s，退火温度 57°C 30 s，72°C 20 s，40 个循环； b.结果分析； 根据扩增结果判定:在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检 测；再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值> 35为阴性。
【文档编号】C12Q1/70GK103436633SQ201310269949
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月29日 优先权日:2013年6月29日
【发明者】刘湘涛, 吴锦艳, 田宏, 陈妍, 尚佑军, 尹双辉, 王光祥, 张克山, 杨顺利, 刘永杰, 宋江伟 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所