甘蓝型油菜全基因组scar分子标记及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用，人工创造的甘蓝型油菜全基因组的SCAR标记110个，其步骤：（1）在白菜基因组序列数据库和甘蓝基因组序列数据库，每间隔一段长度挑选序列；（2）搜索与所得序列同源性最高的甘蓝型油菜序列；（3）比较与所得Tapidor和Ningyou7同源序列的差异；根据差异序列设计PCR扩增引物；（4）利用所得PCR引物，扩增Tapidor和Ningyou7基因组DNA，产生SCAR分子标记；（5）筛选得到在油菜品种稳定扩增的阳性标记PS3+21和RAC1-P3+4，作为SCAR标记检测体系的阳性对照；（6）利用所得SCAR分子标记鉴别冬油菜品种。本发明极大地节约人力物力、缩短鉴定周期、提高新品种鉴定效率，提供了一种方便快速鉴定甘蓝型油菜不同品种的方法。
【专利说明】甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于油菜育种【技术领域】，具体涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标 记，同时还涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，还涉及一种甘蓝型油 菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002] 粮食安全是我国国民经济的基础和人民生活的重要保障，种子是粮食生产的最核 心要素。我国消费的植物油60%以上依靠进口，自给率不足40% ;国产植物油约60%的原料 来自于油菜籽。杂交种的选育和推广促进了我国油菜品种产量的大幅度提高，品种更新换 代速度加快。开发鉴别品种和鉴定杂种纯度的技术体系用于种子质量管理非常必要和紧 迫。
[0003] 现有的油菜品种鉴定和杂种纯度检测方法主要包括传统的形态学方法和分子检 测方法。形态学方法依据的是油菜全生育期的表型性状如叶型、叶色、株高、株型、生长势、 花期、产量性状、品质性状等，目标性状有限、且易受外界环境影响(刘华等，1997)。另外，形 态学鉴定方法需要田间种植、并在油菜全生育期多次进行观察，非常费时费力。分子检测方 法是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础、在分子水平检测生物间的差异。分子检 测方法能对各个发育时期的个体、各个组织甚至细胞做检测，标记数量多、不受环境影响。
[0004] 自 1980 年第一个分子标记技术 一RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性，）产生以来，已经出现的分子标记技术有几十种，它 们的原理为DNA分子杂交、DNA分子扩增，以及DNA分子杂交结合分子扩增。每一种分子标 记技术在检测的基因序列、多态性水平、位点的特异性、重复性、技术要求以及检测成本等 方面各有差异和优缺点。我国自2003年启动甘蓝型油菜品种DNA指纹检测以来，相继经历 了 AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism，扩增片段长度多态性）、SSR (Simple Seque nce Repeats，简单重复序列）和 ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats，简单重复 间隔序列）三种标记技术，其中SSR标记技术由于重复性好而得到重视。尽管如此，SSR标 记技术检测油菜品种DNA指纹存在两大不足：（1)年份、品种、不同操作者所得数据不能整 合；（2)分子扩增的品种DNA指纹需要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行检测，操作程序复 杂、花费时间长、对操作者技术水平要求高。
[0005] SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions，序列特征性扩增区域)，是 1993年Paran (Sartorato et al.，2000)提出的分子标记，基本原理是将特异扩增产物进行 回收测序，根据测序结果重新设计特异引物，对基因组DNA进行特异PCR扩增(赵军胜等， 2012)。SCAR技术只扩增特定DNA区域，结果仅仅是标记"t'或'无'，判别容易，可用琼脂 糖凝胶电泳技术进行检测，操作简单，不需要DNA测序仪等精密仪器。SCAR技术可以克服 SSR技术的缺点，但是开发SCAR标记的前提是已知差异扩增片段及其序列，由于特异扩增 产物回收测序成本高，因而SCAR标记的数量受到限制，规模化开发SCAR标记的报道尚无。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记，该标记 具有可用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测、操作简单，扩增结果为"有"或"无"、判别容易、便 于统计等优点，适用对象广泛。
[0007] 本发明的目的之二在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备 方法。该方法利用了白菜和甘蓝、以及甘蓝型油菜的基因组序列信息，具有覆盖油菜全基 因组、数量多、成本低等优点，另外利用在任何油菜品种均能有扩增产物的标记作为阳性对 照，保证了 SCAR分子标记结果正确。
[0008] 本发明的目的之三在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型 油菜品种鉴定和杂种种子纯度检测中的用途，具有操作程序简单、周期短等技术优势，不同 年份、不同品种、不同操作者所得数据均能整合，因而，可以构建历年和当前油菜品种的DNA 指纹数据库，并利用指纹库信息进行杂种种子纯度检测。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现：
[0010] 申请人:通过序列查询、比对和引物设计，筛选到分布甘蓝型油菜全基因组的SCAR 标记110个；得到两个阳性标记？53+21和狀(：1-?3+4以确保检测结果正确；检测2011-2012 年国家区域试验冬油菜品种（172份)以验证可用于SCAR分子标记鉴定油菜品种；创建SCAR 标记技术体系应用于品种鉴定和杂种纯度检测的方法。
[0011] 一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，其步骤如下：
[0012] (1)在白菜基因组序列数据库（http://brassicadb. org/brad/)和甘蓝基因组序 列数据库（http://122. 205. 95. 67/blast/blast. php)，每间隔 IOOkb 挑选一段 IOkb 长度的 序列。
[0013] (2)搜索与步骤1)所得序列同源性最高的甘蓝型油菜Tapidor序列和Ningyou7 序列。
[0014] (3)比较与步骤2)所得Tapidor和Ningyou7同源序列的差异；根据差异序列设 计P CR扩增引物。
[0015] (4)利用步骤3)所得PCR引物，扩增Tapidor和Ningyou7基因组DNA ;筛选能产 生清晰、稳定、在Tapidor和Ningyou7中有差异扩增带的引物110对，产生110个SCAR分 子标记。引物序列和标记的详细信息列于表1。
[0016] 表1本发明筛选的特异引物
[0017]
【权利要求】
1. 一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记，其特征在于：人工创造的甘蓝型油菜全基 因组的SCAR标记110个：
2.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，其步骤是： (1) 在白菜基因组序列数据库和甘蓝基因组序列数据库，每间隔l〇〇kb挑选一段10kb 长度的序列； (2) 搜索与步骤1)所得序列同源性最高的甘蓝型油菜Tapidor序列和Ningyou7序列； (3) 比较与步骤2)所得Tapidor和Ningy〇u7同源序列的差异；根据差异序列设计PCR 扩增引物； (4) 利用步骤3)所得PCR引物，扩增Tapidor和Ningyou7基因组DNA ;筛选能产生清 晰、稳定、在Tapidor和Ningyou7中有差异扩增带的引物110对，产生110个SCAR分子标 记； (5) 筛选得到在油菜品种稳定扩增的阳性标记PS3+21和RAC1-P3+4,长度分别为 1300bp和200bp，作为SCAR标记检测体系的阳性对照： 阳性SCAR标记PS3+21 : 正向引物 5' -ATGAAAGGGGTACAGAACAT-3'， 反向引物 5' -CTCAAGTCCCACTGCTGCGG-3' ； 阳性 SCAR 标记 RAC1-P3+4 : 正向引物 5' -CTATCCTCCGTCTCGATCTCGC-3'， 反向引物 5' -CTTAGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3' ； (6) 利用步骤4)所得SCAR分子标记鉴别冬油菜品种。
3. 权利要求1所述的一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定 中的应用。
4. 权利要求1所述的一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜杂种种子 纯度检测中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104278025SQ201310288826
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】马朝芝, 张彤, 高长斌, 孙红伟, 王津津 申请人:华中农业大学