库蚊黄病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种库蚊黄病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针是根据库蚊黄病毒E基因区段的保守区域设计。试剂盒中包括的上游引物：5'-CACGCCGAACGGACTTCT-3’，下游引物：5’-TCCATTGGCCGCCATATATC-3’、TaqMan探针序列：5'-TTTCGCACCGGAGCAGCCG-3’，5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团，扩增的目前片段长度为62bp。该试剂盒可用于检测库蚊黄病毒，具有良好的灵敏度性和特异性，能检测到库蚊黄病毒的最低病毒滴度为10PFU/反应。
【专利说明】库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及库蚊黄病毒 的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 库蚊黄病毒（Culexflavivirus，CxFV)是一种蚊传虫媒病毒，属黄病毒科 黄病毒属，于2003年由日本学者在淡色库蚊（Culexpipiens)和三带_库蚊（Culex tritaeniorhynchus)中首次分离到病毒，随后相继在印度尼西亚、美国、西印度群岛特立尼 达、非洲乌干达、南美洲秘鲁、巴西、台湾地区和我国的山东省、辽宁省等地的多种库蚊属蚊 虫中分离到该病毒。随着近年CxFV在全球不同地区的陆续发现，可以将CxFV分为两种基 因型，在两种型别内均存在致细胞病变和非致细胞病变两种表现型。
[0003] 目前，对蚊虫中CxFV的检测主要采用病毒分离和病毒核酸的普通PCR检测。病毒 分离耗时且无法用于非致病变表型CxFV的检测，普通PCR快捷特异，但易造成污染且检测 敏感性低。TaqManReal-timePCR是一种实时荧光定量的检测方法，通过检测体系中荧光 强度的动态变化对核酸进行定性、定量分析体外扩增技术。本研究利用TaqManReal-time PCR技术建立了针对CxFV特异、快捷、敏感、有效的分子检测方法，为媒介中CxFV的监测与 检测提供了技术支持。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了针对库蚊黄病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探 针。
[0005] 本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据库蚊黄病毒E基因区段最为保守的保 守区域设计的，即可用于检测库蚊黄病毒，也可用于定量检测样本中库蚊黄病毒的核酸拷 贝数。
[0006] 所述引物与探针序列分别为：库蚊黄病毒上游引物：CxFV-E-F: 探针：CxFV-E-Probe:FAM5'-TITCgCACCggAgCAgCCg-3'TAMRA，5'端标记FAM荧光报告基团、 3'端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0007] 所述库蚊黄病毒25uL实时荧光定量RT-PCR检测反应体系，包括： 2XReactionMixl2.L、EnzymeMixliiL、10iiM上下游引物与 5iiM探针各 1iiL、RNA模 板 1UL、Nuclease-freewater7. 5yL。
[0008] 所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系的最佳扩增条件为：先 45°ClOmin;然后 95°ClOmin;最后 95°C15s和 60°C60s40 个循环。
[0009] 所述库蚊黄病毒实时突光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有突光定量PCR反 应仪。
[0010] 所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应构建的病毒数定量分析模型最低 检测限为10PFU/反应。
[0011] 所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应通过与普通PCR检测方法对蚊虫 标本的检测应用比较，结果显示该方法具有较常规PCR检测法更加敏感、特异、简便和不易 污染的特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为对库蚊黄病毒的特异性检测的扩增曲线；
[0013] 图2为10倍系列稀释定量库蚊黄病毒的实时荧光定量RT-PCR检测病毒滴度PFU 定量分析扩增曲线；
[0014] 图3为库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度的病毒滴度PFU定量分析标 准曲线；
【具体实施方式】
[0015] 本发明库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法是基于TaqMan Real-time PCR 实时荧光定量检测技术，利用在反应体系中加入荧光基团后产生的荧光信号积累的动态变 化，从而实时监测整个反应进程，最终可通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本 发明还涉及上述检测方法建立所包含的所有内容。
[0016] 该方法具体步骤为：
[0017] (1)引物与探针的设计
[0018] 选择GenBank发表的世界各地不同年代不同地区分离得到的具有代表性的50株 库蚊黄病毒的全基因组序列，用生物信息学分析软件ClustalXl. 8进行E片段基因的序列 比对，根据TaqManPCR引物、探针设计原则，选择最为保守的1031-1111区域作为扩增的 目的基因片段。在此区域内利用PrimerExpreSs3.0辅助设计引物及探针序列，然后进行 Blast分析验证E片段基因的广谱性和特异性。序列信息见表1。
[0019] 表1CxFV检测体系特异引物与探针序列信息
[0020]
【权利要求】
1. 一种库蚊黄病毒实时突光定量PCR检测方法及试剂盒，其特征在于包含一对特异性 引物与一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为62bp，引物与探针是根据库蚊黄病毒E 基因区段最为保守的保守区域设计的，用以定量检测样本中库蚊黄病毒的核酸拷贝数。所 述引物与探针序列分别为： 引物：CxFV-E-F :5, -CACGCCGAACGGACTTCT-3， CxFV-E-R :5' -TCCATTGGCCGCCATATATC-3' 探针：CxFV-E-Probe :FAM5, -TTTCgCACCggAgCAgCCg-3, TAMRA。
2. 根据权利要求1所述的一种库蚊黄病毒实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，其特 征在于由以下几部分组成： (1) 选择库蚊黄病毒E基因区段最为保守的保守区域为靶目标，其基因片段的扩增目 标的核苷酸序列为： 5 ' -CACGCCGAACGGACTTCTTGAGTTTCGCACCGGAGCAGCCGAGATATATGGCGGCCAATGGA-3 ' ； (2) 应用Primer Express3. 0软件和Primer Primier5. 0软件，设计引物和探针； (3) 探针合成同时进行两端荧光标记，探针5'端标记的荧光报告基团是FAM、3'端标记 的荧光淬灭基团是TAMRA。
【文档编号】C12R1/93GK104342498SQ201310323597
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】王环宇, 梁国栋, 赫晓霞, 何英, 付士红 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 王环宇