高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用。本发明的方法包括表达人糜蛋白酶包涵体，之后对其进行变性和复性处理、纯化，复性过程中调节特定的PH值、温度、稀释比例、添加剂成分，有效地提高了可溶性蛋白的得率，所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性，阳离子交换色谱相对于阴离子交换色谱更适合于重组人糜蛋白酶的纯化，获得高纯度、高活性的重组人糜蛋白酶。重组人糜蛋白酶与糜蛋白酶应用与大鼠烫伤模型具有同样的效果。
【专利说明】高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及高活性重组人糜蛋白酶制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002]糜蛋白酶（Chymotrypsin，CT)，又称胰凝乳蛋白酶，在胰脏中以糜蛋白酶原的形态 生物合成，随着胰液分泌出去。在小肠中，糜蛋白酶原受到胰蛋白酶和糜蛋白酶的作用，转 变成具有活性的a-糜蛋白酶，是丝氨酸肽链内切酶。糜蛋白酶催化中心内的专一性袋穴 较宽，主要作用于芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）等氨基酸形成的肽键。
[0003] 糜蛋白酶的应用主要集中在医疗方面：糜蛋白酶可以分解炎症部位纤维蛋白的凝 结物，促进血凝块、脓性分泌物及坏死组织的溶化分解，从而净化创面，使肉芽组织新生，促 进伤口愈合。在国外，该药在眼科、皮肤科做临床局部应用己被肯定。国内临床上主要用于 眼科手术，也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。近年来随着临床药理学研究 的不断发展，其临床应用范围也日渐广泛。
[0004] 传统的糜蛋白酶制备方法是先将动物胰脏进行酸提取，提取液进行分段盐析，除 去含杂蛋白的上清液，盐析得到的沉淀即为糜蛋白酶原粗品；将粗品糜蛋白酶原再次分段 盐析纯化后用胰蛋白酶激活，酶的活化液用硫酸铵低温结晶后透析、冻干后既得。该生产工 艺生产时间长，收率低，并且耗费大量的试剂，增加了环境净化的成本。同时由于是从牛、猪 胰脏中提取，对动物的健康要求较高，并且有潜在的病毒污染风险。
[0005] 无动物源性、无血浆的生物药物是目前生物药物的国际研发前沿。从1982年第 一个上市的生物药物--重组人胰岛素替代其他从动物胰腺提取的胰岛素的全面成功，到 2008美国FDA批准的第一个无血浆制品一重组凝血酶的上市和销售的成功，研发无动物源 性的重组人糜蛋白酶替代其他从动物胰腺提取的糜蛋白酶符合这一生物药物的发展趋势， 本领域有必要开发重组人糜蛋白酶制备新工艺。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供高活性重组人糜蛋白酶制备工艺和应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种制备高活性人糜蛋白酶的方法，所述方法包括：
[0008] (1)将人糜蛋白酶的包涵体进行变性，分离含有经变性的人糜蛋白酶的上清；
[0009] (2)应用复性液进行复性，所述复性液包括100±10mMTris-HCl;复性时，调节 pH8. 0±0. 2、温度2?20°C(较佳地3?18°C;更佳地4-10°C)、复性液：变性液的体积比 大于8 (较佳地等于9)，经激活获得可溶的高活性人糜蛋白酶。
[0010] 在一个优选例中，所述的复性液中，还添加按照体积〇. 1-0. 8%甘油；较佳地添加 按照体积〇. 4-0. 6%甘油；和/或
[0011] 所述的复性液中，还添加l-10mMGSH;更佳地添加2-6mMGSH;和/或
[0012] 所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶。
[0013] 在另一优选例中，所述的包涵体如下表达：
[0014] (a)将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；
[0015] (b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。
[0016] 在另一优选例中，还包括：破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白 酶的包涵体。
[0017] 在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的人糜蛋白酶的包涵体进行洗涤。
[0018] 在另一优选例中，所述的变性包括：将人糜蛋白酶的包涵体溶解于变性液中变性 0. 5-6小时；所述变性液包含：4-10M尿素，0. 1-lOOmMP-巯基乙醇。
[0019] 在另一优选例中，步骤（2)之后，还包括：DEAE-FFSepharose阴离子交换柱或 CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化；较佳地，应用CM-FF阳离子交换层析柱进 行人糜蛋白酶的纯化。
[0020] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对纯化产物进行冻干。
[0021] 在另一优选例中，所述的方法依次包括：将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体 转化大肠杆菌，发酵培养该大肠杆菌一离心收集细胞一细胞破碎一离心收集包涵体一包涵 体洗涤一包涵体溶解变性一复性一微滤除菌澄清一超滤浓缩一透析一离子柱纯化一浓缩 -透析一除菌过滤一冻干。
[0022] 在另一优选例中，所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符 合2010版药典对于生物制品的要求。
[0023] 在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法获得的重组人糜蛋白酶或其冻干 粉在制备治疗皮肤创伤中的用途；较佳地，所述的重组人糜蛋白酶或其冻干粉与天然人糜 蛋白酶具有相同的效果。
[0024] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1、应用大肠杆菌重组表达人糜蛋白酶，各阶段样品的电泳结果。Linel:诱导前 全菌，Line2:诱导后全菌，Line3:诱导后破菌产物离心上清，Line4:诱导后破菌产物离心 沉淀。
[0026] 图2、复性pH优化试验。将lmL变性液分别缓慢加入到1OmL复性液（1OOmM Tris-HCl，pH8. 0、8. 5、9. 0、9. 5)中。25°C复性 24h后激活 2h，测定酶活性。
[0027] 图3、复性温度优化试验。将lmL变性液分别缓慢加入到温度为4、18、25、37°C， 10mL复性液（100mMTris-HClpH8. 0)中。复性24h后激活12h，测定酶活性。
[0028] 图4、稀释倍数条件优化试验。将lmL变性液分别缓慢加入6、7、8、9mL复性液 (100mMTris-HClpH8.0)中。复性24h后激活12h，测定酶活性。
[0029] 图5、添加剂的优化。将lmL变性液分别缓慢加入到9mL复性液（100mMTris-HCl pH8. 0)、复性液（100mMTris-HClpH8. 0、0?l%(v/v)甘油）、复性液（100mMTris-HCl pH8.0、0.01%(v/v)TritonX-100)中。复性 24h后激活 12h，测定酶活性。
[0030] 图6、将lmL变性液分别缓慢加入到9mL复性液（lOOmMTris-HClpH8. 0)、复性液 (lOOmMTris-HClpH8.0、0.25%(v/v)甘油）、复性液（lOOmMTris-HClpH8.0、0.5%(v/v)甘 油）、复性液（lOOmMTris-HClpH8.0、0.75%(v/v)甘油）、复性液（lOOmMTris-HClpH8.0、l%(v/v)甘油）、复性液（lOOmMTris-HClpH8. 0、1.25%(v/v)甘油）中。复性 24h后激活 12h，测定酶活性。
[0031] 图7、谷胱甘肽（GSH)对糜蛋白酶复性的影响。将lmL变性液分别缓慢加入到9mL 复性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5% 甘油）、复性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5%(v/v) 甘油、ImMGSH)、复性液（lOOmMTris-HClpH8. 0,0? 5%(v/v)甘油、2mMGSH)、复性液（lOOmM Tris-HClpH8.0,0.5%(v/v)甘油、3mMGSH)、复性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5%(v/v)甘 油、4mMGSH)、复性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5%(v/v)甘油、5mMGSH)中。复性 24h后 激活12h
[0032] 图8、激活剂浓度选择。将lmL变性液缓慢加入到三组9mL复性液（lOOmMTris-HCl pH8. 0,0. 5%甘油、2mMGSH)中。复性24h后分别向每组复性液中加入30、60、90u/mL激活 剂激活12h，测定酶活性。
[0033] 图9、DEAE_FFS印harose柱纯化电泳图。泳道1-12:洗脱液1-12;泳道13:上样 液；泳道 14 :marker〇
[0034] 图 10、CM-FF柱纯化rhCTSDS-PAGE电泳图。泳道M:Marker;Lanel:流出 1 ;Lane2: 流出 2 ;Lane3 :流出 3 ;Lane4 :100mMNaCl溶液；Lane5 :200mMNaCl溶液①；Lane6 :200mM NaCl溶液②；Lane7 :300mMNaCl溶液。
[0035] 图11、CM-FF纯化后合并液纯化产物冻干后成品的SDS-PAGE结果。泳道1: Marker;泳道2 :冻干样品。
[0036] 图12、标准曲线。
【具体实施方式】
[0037] 本发明人经过深入的研究，提供了一种应用生物工程重组技术生产高活性重组人 糜蛋白酶的优化工艺，所述工艺包括表达人糜蛋白酶包涵体，之后对其进行变性和复性处 理，复性过程中调节特定的PH值、温度、稀释比例、添加剂成分，有效地提高了可溶性蛋白 的得率、纯度，且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。
[0038] 工艺流程
[0039] 本发明中，糜蛋白酶的总体生产工艺流程如下：发酵离心收集细胞细胞 破碎离心收集包涵体包涵体洗涤包涵体溶解变性复性一微滤除菌澄 清一超滤浓缩一透析一离子柱纯化一浓缩一透析一除菌过滤一冻干。在该 工艺流程中，本发明人对部分流程进行了优化。
[0040] 蛋白的表达
[0041] 本发明人尝试了采用多种表达系统（如酵母系统，大肠杆菌系统）来表达人糜蛋 白酶，结果发现大肠杆菌系统较适于表达人糜蛋白酶，获得包涵体形式的蛋白。
[0042] 研究表明包涵体形成的主要原因是蛋白质表达速度过快，以致蛋白质没有足够 的时间进行正确的折叠；另外由于大肠杆菌的胞质环境是一个还原性的环境，导致蛋白质 中的二硫键无法正确配对，这也是导致包涵体形成的一个重要原因[MisawaS，Kumagai I.RefoldingoftherapeuticproteinsproducedinEscherichiacoliasinclusion bodies.Biopolymers. 1999;51 (4) :297_307]。在研究之初，本发明人曾试图通过低浓度 IPTG诱导或低温等方式促进蛋白的可溶表达，但是表达结果显示这些方法对提高人糜蛋白 酶的可溶表达并无明显效果。也即，只能采取包涵体表达，后续进行变复性获得可溶性蛋白 这一途径。
[0043] 因此，作为本发明的优选方式，所述的包涵体如下表达：(a)将含有人糜蛋白酶编 码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人 糜蛋白酶的包涵体。
[0044] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有编码目的蛋白的DNA序列的表达 载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
[0045] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。
[0046] 培养基因工程菌并使之表达目的蛋白的方法和条件是本领域人员已知的，例如可 采用IPTG或者高温诱导表达。较佳地，采用IPTG诱导表达。
[0047] 在基因工程菌表达了包涵体蛋白后，通常需要进行破菌（S卩：破碎大肠杆菌细 胞），从而释放出包涵体蛋白。破菌的方法没有特别的限制，例如超声破菌或高压均浆破菌。[0048] 破碎细胞后，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵体。分离沉淀通常采取离 心的方法。
[0049] 在获得含有包涵体的沉淀后，优选地还包括洗涤的步骤，这样可以去除与包涵体 混合在一起的脂质体、脂多糖、核酸或杂蛋白等杂质，有利于后续变复性的进行。
[0050] 作为本发明的优选方式，所述的洗涤包括步骤：先应用TritonX-100洗涤1-2次， 再通过1-3次纯水洗涤。
[0051] 蛋白的变性
[0052] 包涵体的变性可以采用多种蛋白变性试剂，例如尿素和盐酸胍，其都可以实现将 包涵体溶解的目的。对于人糜蛋白酶而言，较佳地应用尿素以及巯基乙醇。更佳的变性 方法为：将人糜蛋白酶的包涵体溶解于变性液中变性0. 5-6小时；所述变性液包含：4_10M 尿素，0.l-100mM0 -疏基乙醇。
[0053] 蛋白的复性
[0054] 本发明人在摸索人糜蛋白酶的包涵体的复性条件时，考虑了很多条件，最终确定 pH对人糜蛋白酶的复性影响最大，具体体现为在弱碱性（pH8或9. 5左右之间）条件下人 糜蛋白酶的复性活性较好。同时，温度对于复性也有影响，较佳的温度是2?20°C;更佳地 3?18°C;最佳地4-10°C。同时，复性液：变性液的体积比也有影响，较佳的体积比大于8， 更佳地等于9。
[0055] 作为本发明的优选方式，所述的复性液中，还添加按照体积0. 1-0.8%甘油；较佳 地添加按照体积〇. 4-0. 6%甘油。更佳地，所述的复性液中，还添加l-10mMGSH;更佳地添加 2-6mMGSH。更佳地，所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶。
[0056] 对蛋白进行复性的时候，在选用上述试剂的情况下，可以通过多种途径进行复性， 例如但不限于：稀释复性、透析复性、层析复性等。优选的是稀释复性。
[0057] 复性实验结果表明，在上述优化条件下，获得的人糜蛋白酶的酶活性超过4. 5U/ mlo
[0058]蛋白的纯化
[0059] 在经过蛋白复性后，还可对复性后的蛋白进行纯化。蛋白纯化可采用本领域常用 于蛋白纯化的方法，例如超滤、透析、离子交换层析、分子筛层析等。
[0060] 作为本发明的优选方式，应用DEAE-FFS印harose阴离子交换柱或CM-FF阳离子 交换层析柱进行人糜蛋白酶的进行纯化。
[0061] 作为本发明的优选方式，还包括：对纯化产物进行冻干。
[0062] 本发明的优化工艺通过优化蛋白复性时的PH值、温度、稀释比例以及添加剂，有 效地提高了可溶性蛋白的得率、纯度，以及提高了人糜蛋白酶的活性。所获得的可溶性蛋白 可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。
[0063] 并且，本发明所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合 2010版药典对于生物制品的要求。
[0064] 动物试验表明，本发明所述的方法获得的重组人糜蛋白酶或其冻干粉对于治疗皮 肤创伤具有良好的药效；与天然人糜蛋白酶具有相同的效果。
[0065] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0066] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0067]实施例1、载体构建及表达鉴定
[0068] 根据人源糜蛋白酶氨基酸序列SEQIDN0:1，人工合成基因序列（GeneCT)。Gene CT整合至表达载体pET24a(购自Invitrogen)的Ndel/EcoRI位点中，将重组质粒转化至大 肠杆菌BL21 (DE3)，获得转化子。挑取转化平板上的单克隆菌落，接种至30mlLB培养液中 (含100yg/mlKana)，置于37°C摇床过夜培养（10_12h)后，以2%接种量转入二级瓶中，继 续培养。菌密度至0D6000. 5-0. 6时，加入终浓度为0. 5mmo/LIPTG诱导4h，lOOOOrpm离心 收集菌体，弃上清，菌体超声破碎，离心后获得上清和沉淀，沉淀即为包涵体，对上清和沉淀 进行SDS-PAGE电泳鉴定。
[0069] 人糜蛋白酶氨基酸序列（SEQIDN0:1):
【权利要求】
1. 一种制备高活性人糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 将人糜蛋白酶的包涵体进行变性，分离含有经变性的人糜蛋白酶的上清； (2) 应用复性液进行复性，所述复性液包括100± 10mM Tris-HCl ;复性时，调节 pH8. 0±0. 2、温度2?20°C、复性液：变性液的体积比大于8,经激活获得可溶的高活性人 糜蛋白酶。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复性液中，还添加按照体积0. 1-0. 8% 甘油；较佳地添加按照体积〇. 4-0. 6%甘油；和/或 所述的复性液中，还添加l-l〇mM GSH ;更佳地添加2-6mM GSH ;和/或 所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包涵体如下表达： (a) 将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌； (b) 用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀， 其中含有人糜蛋白酶的包涵体。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的变性包括：将人糜蛋白酶的包涵体溶 解于变性液中变性〇. 5-6小时；所述变性液包含：4-10M尿素，0. 1-lOOmMP -巯基乙醇。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)之后，还包括：DEAE-FF S印harose 阴离子交换柱或CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化；较佳地，应用CM-FF阳离 子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括：对纯化产物进行冻干。
8. 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，该方法依次包括：将含有人糜蛋白酶编 码基因的表达载体转化大肠杆菌，发酵培养该大肠杆菌一离心收集细胞一细胞破碎一离心 收集包涵体一包涵体洗涤一包涵体溶解变性一复性一微滤除菌澄清一超滤浓缩一透析一 离子柱纯化一浓缩一透析一除菌过滤一冻干。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主 DNA、宿主蛋白含量均符合2010版药典对于生物制品的要求。
10. 权利要求1-8任一所述的方法获得的重组人糜蛋白酶或其冻干粉在制备治疗皮肤 创伤中的用途；较佳地，所述的重组人糜蛋白酶或其冻干粉与天然人糜蛋白酶具有相同的 效果。
【文档编号】C12R1/19GK104342423SQ201310323446
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月29日 优先权日:2013年7月29日
【发明者】赵致, 安少朋 申请人:迈格生物医药（上海）有限公司