拮抗土传病害的木霉菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物防治领域的拮抗土传病害的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株为棘孢木霉（Trichoderma?asperellum）ZJSX5003CGMCC?No.6480。本发明的木霉菌菌株的生长速度快、产孢量大，离体对峙病原菌抑制率分别达79.79%、73.68%、72.25%，病原菌孢子存活率均为0.00%，针对黄瓜枯萎病、玉米茎腐病的活体防效分别为85.08%、66.67%，几丁质酶酶活为4.0783U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.8050U，胞外蛋白酶酶活为4.8503U，抗生性次生代谢物中起拮抗作用的聚酮类、萜烯类和羧酸类占总体比重的44.44%；本发明的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该菌株生产的生物农药能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。
【专利说明】拮抗土传病害的木霉菌菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治领域，涉及一株木霉菌菌株，尤其涉及一种拮抗土传病害的木霉菌菌株。
【背景技术】
[0002]由于长时期的连年种植某一作物，造成土壤次生盐溃化严重和土传病害为害加剧，导致作物品质降低，产量下降，现已成为制约设施农业持续发展的重要障碍因子。植物土传病害是一类重要的植物病害，引起土传病害的病原物种类很多(真菌、细菌、线虫、病毒)，它们通常侵染植物根部，引起植物根部乃至全株的病害，造成重大的经济损失。其中，土传病原真菌目前已成为农作物、蔬菜稳产、高产的主要制约因素之一。
[0003]以玉米莖腐病(Corn Stalk Rot)为例简要概述其造成经济损失,又称玉米青枯病，其分布广、危害重，世界玉米各产区均普遍发生，一般年份发病率为10~20%，严重时可达50%以上，导致玉米减产20~30%。引起玉米茎腐病的主要致病病原菌是腐霉菌、镰刀菌、干腐菌、炭疽菌和细菌等。再以黄瓜枯萎病为例，又叫蔓割病、萎蔫病，是土壤传播、根部侵入的一种维管束病害，一般发病率20%~30%，严重地块达80%~90%，甚至全部毁种，严重影响黄瓜生产产量。因此，为了有效防治土传病害、保证我国农作物、蔬菜产量稳定增长，必然需要进行综合防治。其中，由于生物防治绿色无害高效而广受政府、农庄及农户关注，生防微生物资源研究迫在眉睫。而作为国际公认生防菌的木霉菌，近年来优选菌株的应用效果卓著，寻找高效生防能力的木霉 菌株资源非常重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是通过离体对峙培养测定、病原菌孢子存活率测定、盆栽接种试验指标的筛选，提供一种新型拮抗土传病害的木霉菌菌株，本发明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该菌株生产的生物农药，能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。
[0005]本发明是通过以下的技术方案实现的，
[0006]本发明涉及一种措抗土传病咅的木霉囷囷株，所述木霉囷囷株为棘抱木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003 CGMCC N0.6480。
[0007]优选地，所述菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]优选地，所述菌株的Tefl- α序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]本发明提供的木霉菌菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101 ;本发明菌株的信息为:棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003 ;保藏号为 CGMCC N0.6480 ;保藏日期为 2012.8.28。
[0010]菌株培养特征包括:PDA上的最适合生长温度为30°C，30°C生长48h菌落半径约为31~47mm ;30°C黑暗条件下生长期间每隔8h给予短暂的荧光照射，菌落能够形成5个同心轮纹结构，由密集的分生孢子组成，靠近中心部位的分生孢子为黑绿色，缺乏气生菌丝；不产生扩散性色素，无明显气味；菌落反面为奶油色，有皱褶或者有缠绕结构。
[0011]菌株形态特征包括:分生孢子簇呈垫状至半球状，直径为0.5~2mm，离散分布或者汇合，散布于整个菌落或者排列为2~3个同心轮纹；分生孢子聚合体为深绿色。在分生孢子簇内，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端具有两个或多个瓶梗，瓶梗宽度为2.8~5.4 μ m，主轴顶端下面生出的初次分枝常呈对生，与主轴的夹角为近90° ;瓶梗典型地产生于初次、二次、三次分枝的顶端，较少直接产生于初次和二次分枝中部，2~3个瓶梗呈漩涡状排列；瓶梗直、安瓿形，仅在中部稍微加粗，长度为7.1~11.3 μ m，中部宽度为
3.0~5.5 μ m，基部宽度为2.0~3.5 μ m，基部稍微有缢缩，与其母细胞夹角约为100°。分生孢子球形至亚球形或者卵圆形，大小为3.7~6.0 μ mX 3.0~5.0 μ m,没有可见的基部脱落痕迹，有细刺结构，但有时很难观察到。
[0012]本发明采集中国南部地区农林土壤并于4°C保藏、分离纯化菌株、离体对峙病原菌抑制试验(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)、病原菌(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)孢子存活率测定、活体接菌防效试验，经过以上步骤反复筛选，最终选出高拮抗性、强专化性的杀土传病害的木霉菌菌株，编号为ZJSX5003。通过菌落及分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析，确定了该菌株的分类地位:木霉属(Trichoderma Pers.ex Fr.),棘抱木霉(Trichoderma asperellum)。本发明也进行了该菌株的生理生化测定，包括拮抗相关酶酶活(几丁质酶、β -1, 3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)检测、抗生性次生代谢物提取分析，以便更好地开发利用该菌株。
[0013]本发明提供的木霉菌菌株的ITS序列如序列表中的序列I所示(Genebank序列号:JQ617302),其Tef 1-α序列如序列表中的序列2所不(Genebank序列号:JQ617305)。
[0014]本发明的有益效果如下:本发明提供的木霉菌菌株的生长速度快、产孢量大，离体对峙病原菌(尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌)抑制率分别达79.79%,73.68%,72.25%，病原菌(尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌)孢子存活率均为0.00%，针对黄瓜枯萎病、玉米茎腐病的活体防效分别为85.08%,66.67%，几丁质酶酶活为4.0783U，β -1, 3-葡聚糖酶酶活为0.8050U，胞外蛋白酶酶活为4.8503U，抗生性次生代谢物中起拮抗作用的聚酮类、萜烯类和羧酸类占总体比重的44.44%。由上可知本发明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该菌株生产的生物农药能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0016]图1是本发明提供的ZJSX5003菌株中不同类型的抗生性次生代谢物分配比例图。【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0018]本发明通过分离浙江省绍兴市大头菜蔬菜地土壤的886株野生木霉菌株，选取离体对峙尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、串珠镰刀菌作为初筛指标，然后选取病原菌孢子存活率作为复筛指标，最后通过活体接菌防效试验确定木霉菌菌株ZJSX5003。
[0019]实施例1、离体对峙抑菌试齡
[0020]平板对峙培养法:用灭过菌的Φ6.ι的打孔器打取培养4d左右的木霉菌和病原菌(串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌)菌碟，病原菌菌碟分别置于直径90mm的培养皿平板一侧，另一侧接种木霉菌菌碟，两菌碟相距4cm，并以单独病原真菌为对照，3个重复，于28°C恒温培养。培养5d后，采用十字交叉法分别测量处理组和对照组的病原真菌菌落直径，分别计算出培养5d后抑制率。
[0021]菌落生长直径(mm)=菌落直径平均值一 6.0mm ；
[0022]菌丝生长抑制率(％)=(对照菌落生长直径一处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径X 100。
[0023]表1菌株离体抑菌率的测定
[0024]
【权利要求】
1.一种拮抗土传病害的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003CGMCC N0.6480。
2.如权利要求1所述的拮抗土传病害的木霉菌菌株，其特征是，所述菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.如权利要求1所述的拮抗土传病害的木霉菌菌株，其特征是，所述菌株的Tefl-α序列如SEQ ID N0.2所示。
【文档编号】C12N1/14GK103484376SQ201310336701
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2012年9月29日
【发明者】孙瑞艳, 陈捷, 曹磊, 刘志诚, 李雅乾, 张倩月 申请人:上海交通大学