一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂及其制备方法与应用，属于生物防治领域。
背景技术：
：生姜茎基腐病是由腐霉菌侵染引起的一种土传病害，是生姜生产主要的病害之一，严重影响生姜的产量及品质。近年来该病在国内部分生姜主要产区危害严重，并有发展蔓延的趋势，一般发病率30％～80％，严重时部分地块可绝产。该病从生姜出苗1～2个月开始发病，病菌在土壤中长期腐生，借水流、耕作等传播，通过根茎伤口或直接从分枝裂缝及老化幼苗茎基部侵入，然后茎基部出现大小不等的水渍状病斑，逐渐扩大，地上部茎叶仍为绿色，最后老叶变黄萎蔫，病斑环绕茎基部一周，导致茎基部组织逐渐腐烂；在发病严重时，基部变黑2～3天后，茎基部就完全腐烂，从老姜处齐断，病株死亡，又称为“烂脖子病”。生姜茎基腐病病原菌是卵菌纲，腐霉科，腐霉属一种低等真菌，以腐生的方式在土壤中长期存活，寄生于高等植物，危害根部和茎基部，引起腐烂死亡，表现为猝倒、根腐和茎基腐。导致茎基腐病的土壤因素有：土壤粘重、偏酸性；多年重茬致田间病原菌积累易发病；肥料不足，耕作粗放致植株抗性降低易发病；地势低洼积水、排水不良致土壤潮湿等。针对生姜茎基腐病其发病特点及发病规律，目前生产上防治措施主要是化学药剂防治和农业防治；化学药剂防治主要有利用化学药剂进行土壤熏蒸、药剂喷施灌根等，因其见效快等优点，使其在农业生产中被广泛应用；但长期使用会引起环境污染、抗药性、农药残留多，污染大等问题，防治生姜茎基腐病害的液体菌剂保质期短、预防率低。中国专利文献cn101999371a(申请号：201010508770.9)公开了一种防治生姜茎基腐病的制剂，一种防治生姜茎基腐病的制剂，按重量比为：包含有25％甲霜灵54-58％、95％噁霉灵5.5-6.5％和20％琥胶肥酸铜36-40％，该制剂使用了噁霉灵，因此农药残留多，污染大。生物菌剂具有环境友好性、无污染、无残留等优点，具有巨大的应用前景，如：中国专利文献cn105274020a(申请号：201410819811.4)公开了一种生姜茎基腐病菌拮抗细菌及应用，该生姜茎基腐病菌拮抗细菌，命名为洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacenocepacia)c3，已于2014年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.9791。生姜茎基腐病菌拮抗细菌c3对生姜茎基腐病防效达41.18％。但预防效果差，远远达不到实际生姜生产所需要的预防率，导致产量低。木霉菌(trichodermaspp.)属于半知菌门，是一类在土壤中广泛分布的寄生真菌，可用于防治植物叶部病害和根部病害，主要防病机制为产生抗生素、营养竞争、微寄生、细胞壁分解酵素、以及诱导植物产生抗性；长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)，具有较强的适应性，其菌落生长迅速、有明显的轮纹，周围有白色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成绿色；长枝木霉可代谢产生纤维素酶，对卵菌纲真菌菌丝具有分解作用，能够很好的防治生姜茎基腐病。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂及其制备方法与应用，该微生物菌剂具有无残留、无污染，环境友好、活菌量高以及保质期长等优点，对生姜茎基腐病害防治率达到80％以上，为高效生姜茎基腐病防治微生物菌剂，大大提高了生姜的产量和品质。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，包括长枝木霉菌发酵物和混料，所述混料为腐植酸、氨基酸和麦饭石；长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：(3～6):(1～2):(1～2):(4～5)，长枝木霉菌发酵物中有效活菌数大于等于2×109个/g。根据本发明优选的，长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：(3～4):1:1:5。根据本发明优选的，长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：(3.3～3.8):1:1:5。根据本发明，一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)取长枝木霉菌接种于pda斜面培养基上，在25℃～28℃的条件下，活化培养3-5天，制得活化菌株；(2)取步骤(1)的活化菌株接种于种子培养基中，在温度26℃～28℃、转速150～170rpm的条件下振荡培养30～36h，制得种子液；(3)将种子液8％～10％的质量百分比接入固体发酵培养基，培养96h～120h，低温烘干，制得长枝木霉发酵物；(4)将麦饭石、腐植酸、氨基酸粉碎过5-20目筛，然后与长枝木霉发酵物混合均匀，得到微生物菌剂。根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述的pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，制备方法为：将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至1000ml，最后溶液121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。根据本发明优选的，所述步骤(2)中，所述的种子培养基，每升组分如下：麸皮15～20g，玉米粉8～10g，硫酸铵8～10g，水1l，ph自然，121℃高温高压灭菌20min～25min后备用。根据本发明优选的，所述的固体发酵培养基，包括固体物料、无机盐、蔗糖和水，水的重量占固体物料重量的55～65％，无机盐的重量占固体物料重量的1～3％；蔗糖的重量占固体物料重量的0.3％～0.5％，所述的固体物料原料组分及其质量比如下：玉米秸秆粉、麸皮、玉米粉质量比为：2～4：1：1。进一步优选的，所述的无机盐包括硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸亚铁，硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸亚铁分别占固体物料的重量比为：硫酸铵0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.4％～0.5％、硫酸镁0.1％～0.25％、硫酸亚铁0.001％～0.003％。根据本发明优选的，所述的固体发酵培养基是按以下方法制备得到：按质量比取玉米秸秆、麸皮、玉米粉，混合均匀，得固体物料；按配比取蔗糖、(nh4)2so4、kh2po4、mgso4、feso4混合均匀用水溶解，然后与固体物料按1:(1.1～1.2)的质量比混合均匀，ph自然；将混合好的固体培养基经过121℃、25min高温高压蒸汽灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基。根据本发明优选的，步骤(3)接入种子液后调节固体发酵培养基含水量至60％～65％。根据本发明优选的，所述步骤(3)中，培养条件为：温度26℃～28℃培养96h～120h；烘干条件为：45℃～50℃低温烘干至水分含量8～12％；根据本发明，一种微生物菌剂的应用，用于防治生姜茎基腐病，在生姜种植前撒施姜地中，然后进行翻耕：每亩施用量5～10kg。本发明微生物菌剂的混料为腐植酸、氨基酸、麦饭石，三者合理搭配，麦饭石是一种天然的硅酸盐矿物，麦饭石的主要化学成分是无机的硅铝酸盐。其中包括sio2、al2o3、fe2o3、feo、mgo、cao、k2o、na2o、tio2、p2o5、mno等，还含有植物所需的全部常量元素，如：k、na、ca、mg、cu、mo等微量元素和稀土元素，加上配伍的腐植酸和氨基酸，不仅可以改良土壤的品质，而且可活化利用土壤中的残肥，为生姜等农作物提供了充足的养分；本发明微生物菌剂中长枝木霉具有较强的环境适应性，在15～40℃之间都能生长和产孢，能保证长枝木霉菌在土壤中保持一段时期的高种群水平，而不至于在短期内消失，符合生姜作物的生长期防病时期的生防规律，更有利于防病效果的发挥；长枝木霉能将茎基腐病病原菌的细胞壁降解，导致胞内物外渗，抑制病原菌孢子的生成和萌发，进一步使其死亡。本发明微生物菌剂中长枝木霉发酵物和混料中麦饭石具有协同配伍增效作用，混料中麦饭石对某些病毒和有害微生物及重金属元素以及有机物质具有一定的净化能力，长枝木霉发酵物和混料中麦饭石二者配伍，一方面改良土壤、维护有益菌，另一方面让土壤中养分充足、齐全，对生姜等作物的茎基腐病起到协同增效作用；本发明的长枝木霉菌的固体发酵过程简单易操作且无各类杂菌的生长，控制发酵过程中固体培养基的水分含量为60～65％，结合固体发酵的温度，使得发酵过程中的温湿度利于长枝木霉菌的生长，从而不利于各类杂菌的生长。按照本发明微生物菌剂制备方法所制备的长枝木霉菌农用微生物菌剂水分含量在8～12％，活菌数不低于20亿/g，杂菌率＜5％，符合农用微生物菌剂gb2087-2006的指标要求。本发明的微生物菌剂制备时间短，周期为8-12天，菌种活化为3-5天，种子制备约1-2天，接种发酵约4-5天，成品掺混一天，菌剂活菌数检测2-3天，生产时间得到有效缩短，生产效率得到提高。本发明的有益效果在于：1.本发明将长枝木霉发酵物应用于生姜茎基腐病的防治，制备出防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，得到长枝木霉有效活菌数不低于2×109个/g，微生物菌剂产品稳定性好、保质期长，可延长使用期为18-24个月；2.本发明的防治生姜茎基腐病的微生物菌剂对茎基腐霉病的防治率高，可以使生姜茎基腐病发病率大大减少80％以上，并能够提高生姜的产量10％以上，经济效益显著，并提高生姜产品的品质；3.本发明的长枝木霉菌的发酵物与以麦饭石为主要成分的菌剂固相载体复配，制备农用微生物菌剂，长枝木霉发酵物和混料中麦饭石具有协同配伍增效作用，混料中麦饭石对某些病毒和有害微生物及重金属元素以及有机物质具有一定的净化能力，长枝木霉发酵物和混料中麦饭石二者配伍，一方面改良土壤、维护有益菌，另一方面让土壤中养分充足、齐全，对生姜等作物的茎基腐病起到协同增效作用，充分利用了我国麦饭石资源极为丰富的优势，也为麦饭石作为菌剂固相载体提供了新的应用前途；4.本发明的防治生姜茎基腐病的微生物菌剂产品中各成分配伍科学合理，协同增效效果好，生产时间得到有效缩短，生产效率得到提高；5.本发明的防治生姜茎基腐病的微生物菌剂产品替代了化学农药在生姜作物上的应用，减少化学农药的使用以及对生姜产品与种植土壤的危害，不会对害虫天敌造成影响，不会对土壤环境造成污染、在土壤中无残留，很好地解决了由于长期施用化肥产品而给农业生产种植带来的弊端和难题，弥补了化肥产品的缺陷和不足，真正实现了国家对绿色有机环保型微生物菌剂产品的社会效益的产业政策要求；附图说明图1为本发明实施例1长枝木霉菌株在pda培养基上25℃黑暗培养5d得到的菌落形态图；图2为本发明长枝木霉菌株与病原菌腐霉对峙培养效果图；图3为本发明实施例1制得的微生物菌剂产品外观照片。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。实施例和对比例中所用原料和设备均为市售，其中各类培养基均按常规方法配置。接种均在无菌操作台上完成；液体发酵在数显恒温震荡培养箱上完成；灭菌处理在立式高压灭菌锅上完成；固体发酵在2m3的曲池内完成；菌剂复配过程采用不锈钢粉剂搅拌机完成。以下实施例采用的菌种均为长枝木霉trichodermalongibrachiatum，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：cgmcc3.3002。实施例1一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，包括长枝木霉菌发酵物和混料，所述混料为腐植酸、氨基酸和麦饭石；长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：4:1:1:5，长枝木霉菌发酵物中有效活菌数不低于2×109个/g；以上微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：1)长枝木霉菌种活化将从冰箱保存的长枝木霉菌种接种于pda斜面培养基上，25℃培养5天，制得活化菌株；得到的菌落形态如图1所示；pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，制备方法为：将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至1000ml，最后溶液121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。2)种子液制备将pda斜面培养基上菌株孢子用无菌水洗脱接种于种子培养基上，置于摇床培养箱中，26℃、170rpm，振荡培养32h后，得到种子液；种子培养基，每升组分如下：麸皮15g，玉米粉10g，硫酸铵8g，水1l，ph自然，121℃高温高压灭菌20min～25min后备用。3)固体发酵培养基制备按质量比取玉米秸秆、麸皮、玉米粉，混合均匀，得固体物料；按配比取蔗糖、(nh4)2so4、kh2po4、mgso4、feso4混合均匀用水溶解，然后与固体物料按1:1.1的质量比混合均匀，ph自然；将混合好的固体培养基经过121℃、25min高温高压蒸汽灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基。玉米秸秆粉、麸皮、玉米粉质量比为：4：1：1。蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸亚铁分别占固体物料的重量比为：蔗糖0.3％，硫酸铵0.3％、磷酸二氢钾0.4％、硫酸镁0.1％、硫酸亚铁0.001％。4)接种发酵发酵罐温度降至26℃，无菌条件下，从接种口加入长枝木霉种子液，接种量为发酵培养基质量的8％；接种后，控制发酵罐温度26℃，补无菌水至最终物料含水量60％，90rpm搅拌均匀后静置，持续通入无菌空气，发酵120h；45℃低温烘干至含水量10％，得到长枝木霉发酵物；5)制得成品将麦饭石、腐植酸、氨基酸粉碎过10目筛，然后与长枝木霉发酵物混合均匀，得到微生物菌剂产品，产品外观照片如图3所示。实施例2一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，包括长枝木霉菌发酵物和混料，所述混料为腐植酸、氨基酸和麦饭石；长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：3.7:1:1:5，长枝木霉菌发酵物中有效活菌数不低于2×109个/g。制备方法同实施例1。实施例3一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，包括长枝木霉菌发酵物和混料，所述混料为腐植酸、氨基酸和麦饭石；长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：3.4:1:1:5，长枝木霉菌发酵物中有效活菌数不低于2×109个/g。制备方法同实施例1。实施例4一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，包括长枝木霉菌发酵物和混料，所述混料为腐植酸、氨基酸和麦饭石；长枝木霉菌发酵物：腐植酸：氨基酸：麦饭石的质量比为：3:1:1:5，长枝木霉菌发酵物中有效活菌数不低于2×109个/g。制备方法同实施例1。对比例1一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，同实施例1，不同之处在于：该微生物菌剂中不含有麦饭石。实验例对实施例1-4制备的一种防治生姜茎基腐病的微生物菌剂进行检测。农用微生物菌剂活菌数、杂菌率检测方法：培养基为改良高氏一号培养基，1000ml培养基含可溶性淀粉20g、kno31g、k2hpo40.5g、mgso4·7h2o0.5g、nacl0.5g、feso4·7h2o0.01g，琼脂20g，ph值7.2-7.5，120℃高压灭菌30分钟冷却至50-55℃，每300ml培养基中加入3％重铬酸钾1ml，混匀，倾入无菌平皿。将制备好的农用微生物菌剂按照gb2087-2006方法进行梯度稀释后，取10-7稀释度涂布平板，培养3-5天后计数，结果如下表1：表1实施例1-4制备微生物菌剂产品活菌数检测结果实施例1实施例2实施例3实施例4发酵后活菌数94亿cfu/g90亿cfu/g84亿cfu/g80亿cfu/g有效活菌数28亿cfu/g27亿cfu/g25亿cfu/g23亿cfu/g保质期24个月22个月21个月18个月由表1可以看出，本发明制备的防治生姜茎基腐病的微生物菌剂，有效活菌数不低于2×109个/g，保质期在18-24个月。实验例2效果试验：将实施例1～4微生物菌剂施入生姜种植地块中，每亩施入10kg，于种植前撒施翻耕；另设空白组，不施用菌剂产品，其余管理模式与实施例1-4处理完全一致。表2实施例1-4微生物菌剂与空白试验结果结果显示，本发明制备的防治生姜茎基腐病的微生物菌剂可以使生姜茎基腐病发病率大大减少，防治率达到80％以上，并能够提高生姜的产量达到10％以上。实验例3生姜茎基腐病平皿对峙试验对本发明所述长枝木霉菌与生姜茎基腐病进行平板对峙试验，以测试长枝木霉菌对生姜茎基腐病的抑菌效果。将本实施例中所述长枝木霉菌的菌株和生姜茎基腐病病原菌菌株用打孔器打成直径5mm菌丝饼，分别接入9cm的pda培养基的两端，以只接种茎基腐病原菌、不接种本实施例所述长枝木霉菌为对照，并测量菌落直径计算抑菌率。实验结果图片见图2，计算得出对生姜茎基腐病的抑菌率为90.02％。根据以上试验可以证明，以本发明所述长枝木霉菌可以有效抑制生姜茎基腐病的发生，可以作为目前常用化学农药的替代物，对环境不会造成影响。实验例4为了更好的对本发明所述长枝木霉菌防治生姜茎基腐病和长枝木霉菌制成的微生物菌剂的效果进行比对，将实施例1～4及对比例1的微生物菌剂施入生姜种植地块中，每亩施入9kg，于种植前撒施翻耕；实施例1-4与对比例1对生姜茎基腐病防治效果对照如表3中所示。表3本发明微生物菌剂产品与对比例1的微生物菌剂产品对生姜茎基腐病防治效果对照实验结果分析：从表1中可以看出，对照组的病情指数较实施例1-4制备微生物菌剂产品大，防治效果差，其中本发明实施例1-4中所制备的微生物菌剂产品之间对生姜茎基腐病的防治效果无显著差异，所以本发明实施例中所述长枝木霉菌制剂中长枝木霉发酵物与麦饭石配伍使用，可起到配伍增效作用。当前第1页12