同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明属于微生物检测领域，公开了一种快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的方法。针对蜡样芽孢杆菌编码呕吐毒素的cesB和蜡样芽孢杆菌的16SrRNA设计特异性引物，采用叠氮溴化丙锭（PMA）消除食品中蜡样芽孢杆菌死菌的干扰，沸水浴方法提取食品中活菌DNA，进行多重PCR检测。添加非竞争性的扩增内标（IAC）指示PCR体系中可能存在的假阴性结果。本方法避免分子生物学方法检测常有的假阴性和假阳性结果干扰，使检测结果更加准确，同时本方法与传统培养方法相比，检测时间更短。
【专利说明】同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速同时检测食品中产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌活菌的方法。
技术背景
[0002]蜡样芽孢杆菌是一种能产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛分布于空气、污水和各类生熟食品中。目前，从多种食品中分离出该菌，包括炒米饭、肉类、乳类和鱼等，是常见的食源性致病菌，极有可能危害人们的健康。在我国蜡样芽孢杆菌引起的中毒事件比较严重，在1993~2003十年间，蜡样芽孢杆菌中毒者高达1758人。蜡样芽孢杆菌引起的中毒症状主要有呕吐和腹泻，由肠毒素引起腹泻的食源性疾病研究较多，检测方法比较成熟并已经商业化，然而关于蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的研究相对较少，但是呕吐型蜡样芽孢杆菌引发的食物中毒，尤其是米饭类的中毒事件时有发生。在美国，食用炒米饭发生中毒的主要原因是其中污染了产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌。目前，蜡样芽孢杆菌已被挪威和荷兰认定为食品中最容易检出的病源微生物。蜡样芽孢杆菌主要造成食物和饮水不卫生的人群中毒，其中使用受污染的食物是造成蜡样芽孢杆菌感染的主要途径。
[0003]目前检测蜡样芽孢杆菌的方法主要是通过传统的培养方法。传统方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点，且特异性差，易造成大量错误识别。因此快速、准确地检测蜡样芽孢杆菌的方法至关重要。
[0004]蜡样芽孢杆菌的c esB是呕吐毒素合成酶结构基因的一个亚基，能够编码蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素。本发明采用cesB作为靶基因设计引物进行检测，特异性强，能用于对蜡样芽孢杆菌进行准确检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能消除假阴性和假阳性且能同时检测产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的方法。该方法可用于食品样本中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素腊样芽孢杆菌的初筛检测，其操作快速、结果客观准确，避免了现有方法操作繁琐、费时费力和成本闻昂的缺点。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的。
[0007]一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于含有引物分别为:从5’ -3’为
[0008]cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT
[0009]cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC
[0010]16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC[0011 ] 16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG[0012] IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT[0013]IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。
[0014]所述的试剂盒还含有叠氮溴化丙锭PMA，PBS磷酸盐缓冲液，Taq mix。
[0015]本发明涉及一种叠氮溴化丙锭处理结合多重PCR快速同时检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒的检测方法，包括如下步骤:
[0016](1)取食物样本，按质量体积比1:9加PBS缓冲液，充分混匀，离心，取上清得菌悬液；
[0017](2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使PMA的终质量浓度为5 μ g/mL,混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ；
[0018](3)所得DNA进行mPCR，体系包含总共20 μ L反应液，其中，3 μ L制备的模板DNA溶液，10 μ L2 X Taq mix, cesB引物的浓度是0.4 μ M，16S rRNA引物的浓度是0.1 μ M，扩增内标的浓度为0.25μΜ ;反应条件是:95°C lOmin，接着40个循环(94°C 30s, 51 °C 30s，72°C 30s)，最后 72°C延伸 1Omin ；
[0019](4) mPCR反应结束后，进行目的菌检测分析。
[0020]步骤(1)所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。
[0021]步骤(3)所述引物分别为:从5，-3，为
[0022]cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT
[0023]cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC
[0024]16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC
[0025]16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG
[0026]IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT
[0027]IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC
[0028]步骤(4)所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有475bp条带，则指示反应体系正常；若没有出现475bp条带，则反应体系有PCR抑制剂或者PCR操作出现错误，需要重新进行PCR。扩增产物有475bp条带的前提下，若有267bp条带和154bp条带，则说明有产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌；若仅有267bp条带，则说明有不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌。
[0029]与现有技术相比，本发明有如下有益效果:
[0030]针对蜡样芽孢杆菌编码呕吐毒素的cesB和蜡样芽孢杆菌的16S rRNA设计特异性引物，采用叠氮溴化丙锭(PMA)消除食品中蜡样芽孢杆菌死菌的干扰，沸水浴方法提取食品中活菌DNA，进行多重PCR检测。添加非竞争性的扩增内标(IAC)指示PCR体系中可能存在的假阴性结果。本方法避免分子生物学方法检测常有的假阴性和假阳性结果干扰，使检测结果更加准确，同时本方法与传统培养方法相比，检测时间更短。具体如下:
[0031]1、能同时检测产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌，速度快，可以在4小时内得到结果。
[0032]2、只检测活菌，消除假阳性结果，效率更高。
[0033]3、能消除由于食品基质等原因造成的假阴性结果。
[0034]4、本发明涉及的特异性引物，灵敏度高，高效地检测目的菌，操作简便，结果判定简单，降低了检测成本。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1多重PCR检测PMA处理过的死的产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(编号JDZ102Y)电泳结果。M:DL2000DNA Marker ； I~VI泳道为PMA未处理的死菌扩增条带，死菌浓度为
4.0XlO6~4.0X 102CFU/mL ;1~6泳道为PMA处理死菌后的扩增情况。
[0036]图2多重PCR检测PMA处理过的活的产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌电泳结果。M:DL2000DNA Marker ； I~VDI泳道为PMA未处理的活菌扩增条带，活菌浓度为7.5X IO7~
7.5X10°CFU/mL ;1~8泳道为PMA处理活菌后的扩增情况，IX和9泳道为阴性对照。
[0037]图3多重PCR检测污染食品中产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(编号NC0084LY)并获取PMA处理后的检测限。蜡样芽孢杆菌污染面条、米饭和香肠浓度为4.3X IO6~4.3X10°CFU/g ;产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌污染的浓度为3.6X106~ 3.6X100CFU/g。
[0038]图4多重PCR检测污染食品中杂菌存在条件下的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌。面条、米饭和香肠中杂菌(金黄色葡萄球菌PSAV021、沙门氏菌ATCC)的浓度为
1.0X 105CFU/g，蜡样芽孢杆菌的浓度为103CFU/g。泳道I和I为面条样品，泳道2和II为米饭样品，泳道3和III为香肠样品。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例，进一步阐释本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开商业渠道获得。
[0040]实施例1
[0041]一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于含有引物分别为:从5’ -3’为
[0042]cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT
[0043]cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC
[0044]16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC
[0045]16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG
[0046]IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT
[0047]IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。
[0048]所述的试剂盒还含有叠氮溴化丙锭PMA (购于美国Biotium公司)，PBS磷酸盐缓冲液，Taq mix (购于日本TaKaRa公司)。
[0049]具体检测方法如下:
[0050]步骤I，食物样本预处理
[0051]称取Ig的食物样本，加入9mL的PBS，充分混匀，900g离心5min，取上清(该过程必须无菌操作)。
[0052]步骤2，PMA处理
[0053]Ig PMA溶解于ImL 二甲亚砜(DMSO)中，配制成lmg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。取400 μ L步骤I上清液置于1.5mL微量离心管中，加入2 μ Llmg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5 μ g/mL ；PMA与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5 min,利用500W的卤素灯曝光5min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于9000g离心5min，所得沉淀用于DNA的提取。
[0054]步骤3，基因组DNA的提取
[0055]经步骤2获得的样品以9000g,4°C离心5min,弃上清,并小心吸走残余液体，加入30 μ L无菌的去离子水100°C煮沸lOmin，待冷却后12000g，4°C条件下离心5min，取上清作为mPCR反应模板，制备的模板应立即用于PCR检测。
[0056]步骤4，选取靶点及设计引物
[0057]多重PCR之所以难做，问题的关键是多个靶点扩增条件不兼容。每个靶点都需要两边的引物同时配合。因此，本发明分别选取产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌特异性基因，采用01igo7软件设计多重PCR引物，调整各对引物之间的退火温度，并调节引物对之间的扩增配合程度，使各对引物的退火温度尽量一致，扩增速度尽量相等。并通过实验来用产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌作模板来验证多重PCR的扩增效果，选取条件最优的引物对来作为下面检测用引物。并采表1提供的菌株进行引物特异性验证，菌株的编号和来源见表1。
[0058]表1供试菌株及检测结果
[0059]`
【权利要求】
1.一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于含有引物分别为:从5’ -3’为
cesB-V: ACCCATCTTGCGTCATT
cesB-R: CAGCCAAGTGAAGAATACC
16S-V: GCGGCGTGCCTAATACATGC
16S-R: CTCAGGTCGGCTACGCATCG
IAC-F: CCTACGGGAGGCAGCAGT
IAC-R: CGTTTACGGCGTGGACTAC 。
2.根据权利要求1所述的一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于还含有叠氮溴化丙锭PMA，PBS磷酸盐缓冲液，T^mix0
3.根据权利要求1或2所述的一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒的检测方法，其特征在于包含下列步骤: (1)取食物样本，以按质量体积比1:9加无菌缓冲液，充分混匀，离心，取上清得菌悬液； (2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使叠氮溴化丙锭PMA的终质量浓度为5μ g/mL,混匀后室温避光5 min,每隔30 s摇匀一次,曝光,光照交联时样品置于冰上,交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ； (3)所得DNA进行mPCR，体系包含总共20μ L反应液，其中，3 μ L制备的模板DNA溶液，10 μ L 2 X 7^mix，ce.^引物的浓度是0.4 μΜ，7必引物的浓度是0.1 μΜ，扩增内标的浓度为0.25 μΜ;反应条件是:95 V 10 min，接着40个循环(94°C 30 s, 5TC 30s，72°C 30 s)，最后 72°C 延伸 10 min ； (4)mPCR反应结束后，进行目的菌检测分析。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有475 bp条带，则指示反应体系正常；若没有出现475 bp条带，则反应体系有PCR抑制剂或者PCR操作出现错误，需要重新进行PCR ； 扩增产物有475 bp条带的前提下，若有267 bp条带和154 bp条带，则说明有产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌；若仅有267 bp条带，则说明有不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌。
【文档编号】C12Q1/04GK103725771SQ201310352410
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年8月13日 优先权日:2013年8月13日
【发明者】李林, 杨晓慧, 许恒毅, 徐波 申请人:无锡中德伯尔生物技术有限公司