一种无动物来源成分的细胞培养用微载体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种无动物来源成分的动物细胞培养用微载体及其制备方法，该微载体是利用多肽或者促细胞粘附蛋白作为配基，用ATRP方法将配基接枝于经活化的葡聚糖等微球表面而合成的一种无动物来源成分的微载体。该微载体表面包被有人工合成的多肽或非动物来源的蛋白，具有和动物明胶相似的性质，有利于细胞的快速附着和扩展以及细胞的高密度生长，该配基既提供了良好的细胞贴附机会，又不引入动物源性质，克服了细胞大规模培养过程中因引入动物源成分可能带来的产品质量及安全性问题。
【专利说明】一种无动物来源成分的细胞培养用微载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化工程和动物细胞工程领域，具体涉及一种动物细胞培养用微载体，特别涉及一种无动物来源成分的含有氨基酸或者多肽配给以及细胞粘附因子的微载体以及其制备方法和其用于细胞培养的方法。
【背景技术】
[0002]微载体培养技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过几十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293 细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。
[0003]良好的细胞培养微载体具有以下特点:表面积/体积(S/V)大，因此单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单 的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；放大容易；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间小。
[0004]贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有黏附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的黏附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性以及微载体表面理化性质等。
[0005]目前市面上常用的微载体有两类，他们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子，一类是以带正电荷的化合物DEAE (二乙氨乙基Diethylaminoethyl) 作为配基,用于一般的动物细胞培养，比如GE的Cytodexl，另一类是利用变形的动物明胶-猪胶原蛋白作为配基，通过共价交联在葡聚糖微球表面，为细胞的贴壁生长提供附着，从而增加细胞粘附和增值，该载体更适用于一些不容易贴附的细胞培养。
[0006]经过文献检索，BeumJun Kim 等在《Batch, fed-batch, and microcarrier cultures with CHO cell lines in a pressure-cycle driven miniaturized bioreactor.Biotechnol Bioeng.2012 Jan; 109 (I): 137-45》中利用小规模化的生物反应器悬浮培养CHO细胞生产用于商业目的的人源IgG，虽然与传统的滚瓶培养相比能有效的提高革巴蛋白产量，但是其仍然使用的是表面包被动物来源蛋白的Cytodex 3,不利于下游纯化。
[0007]目前已经有的动物细胞培养用微载体大多数以动物胶原及其衍生物作为包被材料，为克服因应用含有动物来源成分的微载体于动物细胞大规模培养过程中而带来引入病毒的风险以及由此引起的产品申报和监管困难，市场上迫切需要一种不含有动物胶原等动物源材料作为配基的新型细胞培养用微载体，以建立在整个过程中无动物来源成分的细胞培养系统和方案。
【发明内容】
[0008]本发明提供一种无动物来源成分的含有氨基酸或者多肽配基的微载体及其制备方法和其用于动物细胞培养的方法，将该微载体用于动物细胞培养，细胞在微载体表面可以快速附着和扩展，有利于细胞的高密度生长，因为不引入动物源性成分，克服了细胞大规模培养过程中因引入动物来源成分可能带来的产品质量及安全性问题。
[0009]本发明的技术方案如下:
一种无动物来源成分的细胞培养用微载体，由配基和三维载体基质通过交联剂交联而成，所述配基为氨基酸聚合物或者人工合成的多肽或者促细胞粘附蛋白，所述配基交联于所述三维载体基质的表面。
[0010]优选地，所述三维载体基质的材料选自葡聚糖，壳聚糖，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的一种或几种。
[0011]一种上述的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，包括以下步骤:
1)采用表面化学修饰试剂处理三维载体基质，在其表面生成活性基团；
其中，三维载体基质表面的活性基团优选包括卤代原子、氯甲基、溴甲基、氨基中的一种或几种，优选表面化学修饰试剂选自2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、3-氨甲基硅烷、2-氯丁酰氯中的一种或几种。这些活性基团具有很好的接枝处理性能。表面化学修饰试剂与三维载体基质反应的温度为60-100°C，反应时间为2-5h，采用的溶剂为水或其他自由液，反应物的浓度为1-20 mg/ml,在无氧条件下进行。采用其它修饰试剂时,本领域技术人员可根据一般知识进行反应条件的选取；
2)在步骤I)的三维载体基质的活性基团上接枝含环氧基团的聚合物；含环氧基团的聚合物例如环氧乙丙烷等任何可用的试剂，优选采用原子转移自由基聚合(ATRP)方法在三维载体基质的活性基团上接枝含环氧基团的聚合物，此外还可以使用RAFT接枝方法；反应条件与常用ATRP或RAFT反应条件相同；本领域技术人员可根据一般知识进行反应条件的选取；
3)在步骤2)的三维载体基质的含环氧基团的聚合物上接枝配基原料，所述配基原料为天然精氨酸、全人工合成的多聚精氨酸，或者人工合成的多肽， 或者促细胞粘附蛋白，得到所述微载体；优选配基通过开环反应的方法接枝于三维载体基质的含环氧基团的聚合物上。本领域技术人员可根据一般知识进行反应条件的选取。
[0012]每步反应完毕后均需对产物做一般性后处理，如洗涤等，具体可视情况选用。
[0013]优选地，步骤2)的接枝过程中使用到的催化剂包括溴化铜、氯化铜、溴化亚铜、氯化亚铜等中的一种或几种，催化剂配体包括PMDETA、联吡啶等中的一种或两种。
[0014]本发明还提供上述的无动物来源成分的细胞培养用微载体用于细胞培养的用途。
[0015]上述的无动物来源成分的细胞培养用微载体用于细胞培养的方法，与现有的商业化Cytodexl和Cytodex 3的细胞培养方法类似,包括如下步骤:
1)微载体的灭菌和预处理；
2)接种细胞并培养；
3)在细胞培养装置中培养扩增细胞；
4)细胞收获，分离细胞和微载体。[0016]本发明的动物细胞培养用微载体及其制备工艺和使用方法具有以下优点:
1、本发明的微载体表面配基为氨基酸聚合物或人工合成的多肽，都属于非动物来源， 不但利于下游纯化，而且具有更可靠的安全性；
2、本发明的微载体避免了利用动物胶原蛋白带来引入病毒的风险，更利于产品申报和
监管；
3、本发明的微载体原材料来源广泛，其三维载体基质不限于葡聚糖，还包括壳聚糖，明胶，聚苯乙烯，海藻酸钠，phema (聚2_轻乙基甲基丙烯酸)等天然和合成高分子材料,成本低廉；
4、本发明的微载体表面的活化官能团通过ATRP方法接枝含环氧基团的聚合物，再利用ATRP法接枝氨基酸聚合物或人工合成的多肽，氨基酸聚合物或人工合成的多肽通过开环反应的方法接枝于表面，制备工艺简单，利于工业化生产；
5、使用本发明的微载体大规模培养动物细胞，其使用方法类似现有的商业化Cytodexl 和Cytodex 3，使用方便，而且可以回收，能重复多次使用。
[0017]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明实施例1的载体形态图；
图2是本发明实施例1细胞培养生长曲线图；
图3是本发明实施例2的细胞 长满载体的形态图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0020]实施例1
本实施例的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备如下:
1)在配备磁子的25mL圆底烧瓶中依次加入葡聚糖微球(G50)1.0 g, 二甲基亚砜 (DMSO)IO mL，缓慢加入2-氯丙酰氯1.0 g，在室温下轻微搅拌反应1.0 h，产物离心弃掉上清液，用IOOmL甲醇洗3-5次后，残余溶剂挥发掉，得到表面化学修饰的含有大量氯原子的葡聚糖微球1.5g，产率75%;
2)在配备磁子的25mL圆底烧瓶中加入上述氯原子修饰的微球1.0g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 1.0g、二甲基亚砜(DMSO) 10ml，用翻口塞密封，通氮气半小时除氧，然后加入氯化亚铜(CuCl) 0.26 g、五甲基二乙烯三胺(PMDETA) 0.45g，把整个反应体系通氮气半个小时，除去体系中残存的氧气，然后把烧瓶置于60 °C的油浴中反应4 h;反应结束后打开瓶盖暴露于空气中，使反应终止；将反应粗产物离心,弃掉上清液,用甲醇洗3-5次后，残余溶剂挥发掉，得到表面化学修饰的含有环氧基团的葡聚糖微球1.lg，产率55% ；
3)在配备磁子的50mL圆底烧瓶中加入人工合成的多肽1.0g、去离子水15mL,加热搅拌溶解后，加入四氢呋喃10mL、上述环氧基团修饰的葡聚糖微球lg，把烧瓶置于60 °C的油浴中反应10 h，粗产物用大量去离子水洗3-5次，然后将产物置于真空烘箱中，减压除掉残余水分，称重得1.05g产物，收率52.5%。
[0021]将以上得到的微载体用于动物细胞培养，具体培养方法如下:
1、对上述微载体用PBS磷酸盐缓冲液浸泡，然后灭菌处理；
2、在125ml转瓶中，按照2*105/ml细胞密度接种Vero细胞，35rpm培养；
3、每天取样100微升显微镜下观察，并用结晶紫染色；
4、绘制细胞生长曲线。载体形态和细胞生长曲线见附图1和附图2。
[0022]图1为本实施例1所制备的载体显微镜下观察的形态图，图中可以看出，本实施例制备的载体表面光滑，透明度好，细胞大小分布比例合适。
[0023]图2是本实施例1的Vero细胞生长曲线，图中可以看出，Vero细胞状态良好，生长曲线具有明显的指数期和衰亡期，最高密度达到1.2*106/ml。
[0024]
实施例2
本实施例的无动物来源成分 的细胞培养用微载体的制备如下:
1)在配备磁子的25mL圆底烧瓶中依次加入葡聚糖微球(G50)1.0 g, 二甲基亚砜 (DMSO)IO mL，缓慢加入2-溴丙酰溴1.0 g，在室温下轻微搅拌反应1.0 h，产物离心弃掉上清液，用IOOmL甲醇洗3-5次后，残余溶剂挥发掉，得到表面化学修饰的含有大量溴原子的葡聚糖微球1.5g，产率75%;
2)在配备磁子的25mL圆底烧瓶中加入上述溴原子修饰的微球1.0g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 1.0g、二甲基亚砜(DMSO) 10ml，把整个反应体系通氮气半个小时，加入溴化亚铜(CuBr) 0.22 g、五甲基二乙烯三胺(PMDETA) 0.23g，再通氮气半个小时除去体系中残存的氧气，然后把烧瓶置于60 °C的油浴中反应4 h，反应结束后打开瓶盖暴露于空气中，使反应终止；将反应粗产物离心，弃掉上清液，用甲醇洗3-5次后，残余溶剂挥发掉，得到表面化学修饰的含有环氧基团的葡聚糖微球1.15g，产率57.5% ；
3)在配备磁子的50mL圆底烧瓶中加入人工合成的多聚精氨酸1.0g、去离子水15mL，力口热搅拌溶解后，加入四氢呋喃10mL、上述环氧基团修饰的微球1.0g,把烧瓶置于60 "€的油浴中反应10 h，粗产物用大量去离子水洗3-5次，产物置于真空烘箱中，减压除掉残余水分，称重得1.06g产物，收率53%。
[0025]将以上得到的微载体用于动物细胞培养，具体培养方法如下:
1、对上述微载体用PBS磷酸盐缓冲液浸泡，然后灭菌处理；
2、在500ml转瓶中，按照载体浓度5g/L，细胞密度3*105/ml接种MDCK细胞，间歇搅拌 5h,结束后35rpm培养；
3、每天取样100微升显微镜下观察，并用结晶紫染色；
4、绘制生长曲线，细胞长满载体的形态见附图3。
[0026]图3是本实施例2的细胞长满载体的形态:MDCK细胞长满微载体，细胞贴附良好， 细胞长满整个载体，载体之间由于细胞分泌物质，形成“细胞桥”现象。
[0027]实施例3
本实施例的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备如下:
I)在配备磁子的25mL圆底烧瓶中依次加入壳聚糖微球(G50)1.0 g，二甲基亚砜 (DMSO)IO mL，缓慢加入2-溴丙酰溴1.0 g，在室温下轻微搅拌反应1.0 h，产物离心弃掉上清液，用IOOmL甲醇洗3-5次后，残余溶剂挥发掉，得到表面化学修饰的含有大量溴原子的壳聚糖微球1.5g，产率75%;
2)在配备磁子的25mL圆底烧瓶中加入上述溴原子修饰的微球1.0g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 1.0g、二甲基亚砜(DMSO) 10ml，把整个反应体系通氮气半个小时，加入溴化亚铜(CuBr) 0.22 g、五甲基二乙烯三胺(PMDETA) 0.23g，再通氮气半个小时除去体系中残存的氧气，然后把烧瓶置于60 °C的油浴中反应4 h，反应结束后打开瓶盖暴露于空气中，使反应终止；将反应粗产物离心，弃掉上清液，用甲醇洗3-5次后，残余溶剂挥发掉，得到表面化学修饰的含有环氧基团的壳聚糖微球1.15g，产率57.5% ；
3)在配备磁子的50mL圆底烧瓶中加入人工合成的粘附蛋白1.0g、去离子水15mL，力口热搅拌溶解后，加入四氢呋喃10mL、上述环氧基团修饰的微球1.0g,把烧瓶置于60 "€的油浴中反应10 h，粗产物用大量去离子水洗3-5次，产物置于真空烘箱中，减压除掉残余水分，称重得1.06g产物，收率53%。
[0028]将以上得到的微载体用于动物细胞培养，具体培养方法如下:制备微载体培养Veix)细胞，细胞培养条件为:细胞接种密度2X105cellS/ml、微载体密度2.0?
2.5g/l、培养终体积100ml、培养液为DMEM/F12+10 % FBS，培养6天，细胞密度可达到 10X105cells/ml，细胞形态良好。
[0029]以上实施例表明，本发明提供的无动物来源成分的细胞培养用微载体能用于细胞培养，并取得了很好的培养效果。
[0030]本发明所列举的各原料和方法都能实现本发明，以及各原料和工艺的上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。`
【权利要求】
1.一种无动物来源成分的细胞培养用微载体，由配基和三维载体基质通过交联剂交联而成，其特征在于，所述配基为氨基酸聚合物或者人工合成的多肽或者促细胞粘附蛋白，所述配基交联于所述三维载体基质的表面。
2.如权利要求1所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体，其特征在于，所述三维载体基质的材料选自葡聚糖，壳聚糖，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的一种或几种。
3.一种无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:1)采用表面化学修饰试剂处理三维载体基质，在其表面生成活性基团；2)在步骤I)的三维载体基质的活性基团上接枝含环氧基团的聚合物；3)在步骤2)的三维载体基质的含环氧基团的聚合物上接枝配基原料，所述配基原料为天然精氨酸、全人工合成的多聚精氨酸，或者人工合成的多肽，或者促细胞粘附蛋白，得到所述微载体。
4.如权利要求3所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，三维载体基质表面的活性基团包括卤代原子、氯甲基、溴甲基、氨基中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述表面化学修饰试剂选自2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、 3-氨甲基硅烷、2-氯丁酰氯中的一种或几种。
6.如权利要求3所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，采用原子转移自由基聚合ATRP方法在三维载体基质的活性基团上接枝含环氧基团的聚合物。
7.如权利要求3中所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，配基通过开环反应的方法接枝于三维载体基质的含环氧基团的聚合物上。
8.如权利要求6所述的无动 物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，ATRP接枝反应过程中，催化剂选自溴化铜、氯化铜、溴化亚铜、氯化亚铜中的一种或几种，催化剂配体选自五甲基二乙烯三胺、联吡啶中的一种或两种。
9.一种权利要求1-8中任一项所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体用于细胞培养的用途。
10.一种权利要求1-8中任一项所述的无动物来源成分的细胞培养用微载体用于细胞培养的方法，其特征在于，包括如下步骤:1)微载体的灭菌和预处理；2)接种细胞并培养；3)在细胞培养装置中培养扩增细胞；4)细胞收获，分离细胞和微载体。
【文档编号】C12N5/07GK103436486SQ201310377955
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】齐念民, 冯见, 陈彦田 申请人:上海瀚正生物技术服务有限公司