用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂及其应用的制作方法
【专利摘要】用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂及其应用。韦兰胶是由鞘氨醇单胞菌合成并分泌到胞外的一类高分子微生物多糖。因其具备优良的假塑流变性、悬浮与乳化性、兼容性、稳定性而日益受到关注。在鞘氨醇单胞菌TP-5（保藏号CGMCCNo.3097）发酵初期，在发酵培养基中分别添加0.05%（m/v）的TritonX-100、0.2%（m/v）的Tween-20、0.2%（m/v）的Tween-40或0.3%（m/v）的Tween-80，能使韦兰胶的产量分别提高21.80%、22.73%、36.62%和28.12%。表面活性剂类携氧剂可望应用于韦兰胶等高粘度多糖的发酵工业中。
【专利说明】用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，具体地说，它涉及几种发酵过程中可能会影响韦兰胶产量的携氧功能物质，及其在高粘度生物多糖发酵生产中的应用。
【背景技术】
[0002]韦兰胶(welan gum)也被称为威伦胶、温轮胶、威兰胶或沃伦胶,是鞘氨醇单胞菌{Sphingomonas sp.TP-5)以碳水化合物为主要原料经好氧发酵合成的一种鞘氨醇胶类聚合物。韦兰胶的结构骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的单元组成，侧链由单链的L-甘露糖或单链的L-鼠李糖构成。由于其具有优良的增粘性、独特的假塑流变性、悬浮和乳化性、酸碱稳定性及耐温性，使得韦兰胶在石油开采、食品、医药、化妆品及建筑行业等多个领域中具有广泛的应用前景。
[0003]韦兰胶是美国Kelco公司80年代继黄原胶、结冷胶之后开发的最有市场前景的微生物多糖之一，迄今为止美国的Kelco公司是韦兰胶全球唯一的生产、供应商，且年供应量只有I万吨，远达不到韦兰胶的实际需求量，供小于求，使得韦兰胶的市场价格居高不下。同时巨大的商业利润使韦兰胶的生产技术被垄断，有关其工业生产技术的论文与专利鲜有报道。而目前国外对于韦兰胶的报道大多集中在结构、性质及应用方面，而在发酵和生产方面的报道很少。我国近年开始对韦兰胶的发酵生产及特性进行研究，然而其工业化进程却十分缓慢，这主要是由于韦兰胶的发酵成本高、单位产率低等因素所致。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是解决韦兰胶等高粘度多糖的发酵生产成本高、产量偏低的问题，提供几种适合在培养基中添加的用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂，及其在高粘度多糖的发酵生产领域的应用。
[0005]本发明提供的一株鞘氨醇单胞菌ΤΡ-5 (保藏号CGMCC N0.3097，该菌株已在ZL200910069960.2号专利中公开)发酵生产韦兰胶过程中添加的携氧剂，所述的携氧剂为表面活性剂类携氧剂 TritonX-100、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80。
[0006]发酵初期，在发酵培养基(m/v)(蔗糖44.68g/L, Na2HPO4 9.28g/L, CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaN03 4g/L、MgS04 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L,ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L和NiSO4 0.02mmol/L构成的微量元素溶液ImL)中分别添加0.05%(m/v)的 TritonX-100,0.2% (m/v)的 Tween-20,0.2% (m/v)的 Tween-40 或 0.3% (m/v)的Tween-80，能使韦兰胶的产量分别提高21.80%,22.73%,36.62%和28.12%。
[0007]本发明的优点和有益效果:
本发明主要是从发酵工程的角度出发，提供一类发酵过程中可能会影响韦兰胶产量的携氧功能物质，旨在最大限度的提高产量，为最终实现韦兰胶的工业化大规模生产提供参考。随着人们对高粘度生物多糖发酵技术的不断进步，本发明的应用可使韦兰胶的产量不断提高，并有助于进一步降低生产成本，扩大应用范围，因此具有很好的发展前景。。[0008]
【专利附图】
【附图说明】[0009]图1是鞘氨醇单胞菌sp.TP-5的摇瓶发酵曲线；
图2是不同氧载体对韦兰胶发酵的影响；
图3是添加正十二烷对韦兰胶发酵的影响；
图4是不同表面活性剂对韦兰胶发酵的影响；
图5是不同表面活性剂加入量对韦兰胶发酵的影响；
图6是H2O2的添加时间对韦兰胶发酵的影响；
图7是H2O2的加入量对韦兰胶发酵的影响。
[0010]
【具体实施方式】
[0011]实施例1韦兰胶的发酵生产
取-80 °C甘油管保藏的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.TP-5 (保藏号为CGMCCN0.3097，该菌株已在ZL200910069960.2号专利中公开)平板划线，置于30°C恒温培养箱中，静置培养3d ;用无菌接种环挑取长势良好的单菌落在装有LB斜面培养基(m/v)(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，琼脂1.5%，pH 7.2 ;121°C灭菌20分钟后降至50°C后将试管倾斜20度待冷却到室温后即成斜面)的试管中划之字线，30°C恒温培养3d ;从活化的LB斜面培养基上挑两环菌体到装有5mL LB液体培养基(m/v)(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，ρΗ 7.2 ;121°C灭菌20分钟)的试管中振荡培养，至试管中菌液变浑浊，以此作为一级种子液，接到内装200mL种子培养基(m/v)(蔗糖15g/L，蛋白胨2.5 8/1，酵母粉1.5 g/L，(NH4)2HPO4 1.5 g/L,K2HPO4 2.5 g/L,MgSO4 0.01 g/L,pH 7，121°C灭菌 30min)的 500mL 三角瓶中，摇床设置为温度30°C，转速200rpm，振荡培养24小时；将培养好的种子液以10%的接种量接入装有 IOOmL 发酵培养基(m/v)(蔗糖 44.68g/L,Na2HPO4 9.28g/L, CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaN03 4g/L、MgS04 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L,ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L和NiSO4 0.02mmol/L构成的微量元素溶液lmL)的500mL三角瓶中，置于往复式恒温摇床中，30°C，115rpm，振荡培养3天左右。
[0012]由图1摇瓶发酵曲线可知，整个发酵过程中pH略有降低；(Tl4h主要是TP-5菌体的生长繁殖和为合成产物的准备阶段，未合成韦兰胶，且开始发酵液只是培养基溶液，粘度较低；14l0h主要韦兰胶产量快速增长的阶段，14h左右开始合成韦兰胶，发酵液粘度随之开始增大，与韦兰胶的产量呈正相关；24h后菌株TP-5产胶率迅速增加，发酵液粘度也随之迅速增长；40h之后进入发酵后期发酵液粘度较高，溶氧不足，韦兰胶的产量开始缓慢增长；发酵进行到66h产物量达到最大值，粘度值也接近最大值，葡萄糖几乎耗尽，72h之后粘度不再显著增大，最大值达3588mPa.s ;再继续发酵不利于韦兰胶的合成，并会增加生产成本。因此，控制发酵周期在66h左右，此时产量为18.05g/L。
[0013]实施例2烷烃类氧载体对韦兰胶发酵的影响
发酵初始时，在发酵培养基(m/v)(蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaN03 4g/L、MgS04 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L,ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L和NiSO4 0.02mmol/L构成的微量元素溶液ImL)中添加不同氧载体,探究它们在不同浓度下对韦兰胶发酵产量的影响，本实验以液态烷烃(包括正庚烷、正己烷、正十二烷、正十六烷)和豆油为氧载体，加入量控制在0-20%之间，发酵70h，用3倍体积的乙醇提取。正十六烷与豆油不溶于乙醇，乙醇提取后会有一部分的正十六烷和豆油吸附在产物中，再用适量的正己烷萃取加以去除。
[0014]结果由图2可知，发酵体系中添加正己烷不能提高韦兰胶的产量，而加入正庚烷后发酵液中几乎不产胶，说明正己烷和正庚烷都不适宜作为韦兰胶发酵的氧载体。正十二烷、正十六烷和豆油都能很大程度上提高韦兰胶的产量，且添加正十二烷的效果最佳。分别添加10%的正十二烷，10%正十六烷，5%的豆油均能起到较好的增产效果，产量分别提高了75.63%,51.15% 和 69.93%。
[0015]发酵初始时，加入不同量的正十二烷，加入量控制在5~10%，考察加入正十二烷后，对韦兰胶产量及发酵液表观粘度的影响。结果如图3所示，整体上添加正十二烷后，韦兰胶的产量和发酵液表观粘度都有所增高，其中加入9%的正十二烷时发酵液表观粘度最大，达5629mPa.s ;加入10%时产量值最大，达28.5 g/L。
[0016]实施例3表面活性剂对韦兰胶发酵的影响
发酵初期，在发酵培养基(m/v)(蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaNO3 4g/L、MgSO4 0.8g/L,以及由 FeCl2 0.0036mmol/L、ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L 和 NiSO4 0.02mmol/L 构成的微量元素溶液 lmL)中添加 0.1% 的 Span-20、Tween-20、Tween-40> Tween-80和TritonX-100,探究不同种类的表面活性剂对韦兰胶发酵产量的影响。结果如图4所示，加入Span-20后未能提高韦兰胶产量，其他几种表面活性剂Tween-20、Tween-40> Tween-80和TritonX-100均能不同程度的提高韦兰胶的产量。
[0017]在发酵初始，加入几种不同的表面活性剂，将加入量控制在0.01%~0.3%之间，探究不同种类的表面活性剂在不同浓度时对韦兰胶产量的影响。由图5所示，这几种表面活性剂在合适的加入量时均能有效`提高韦兰胶的产量，且Tween-40的效果较明显。分别添加0.05% 的 TritonX-100,0.2% 的 Tween-20,0.2% 的 Tween-40,0.3% 的 Tween-80 均能对韦兰胶的发酵起到良好的增产效果，且产量提高率分别为21.80%,22.73%,36.62%和28.12%。
[0018]实施例4添加H2O2对韦兰胶发酵的影响
根据不同阶段韦兰胶发酵的不同特点，选择在0h、llh、23h、35h、48h和58h时分别在发酵培养基(m/v)(蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaNO34g/L,MgSO4 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L、ZnSO4 0.0lmmol/L,MnCl2 0.0lmmol/L 和NiSO4 0.02mmol/L构成的微量元素溶液ImL)中添加0.1%的H2O2，探究不同时间添加H2O2对韦兰胶的产量和发酵液表观粘度的影响。结果如图6所示，与不添加H2O2的对照组相比，无论在哪个阶段添加H2O2，韦兰胶的产量都有小幅度的增加，且对发酵液表观粘度的影响不大。其中在35h和48h发酵的中后期添加，对产量的影响效果较好。
[0019]将H2O2的加入量控制在0.025%~?%的范围内，在发酵35h时添加不同量的H2O2,探究不同量的H2O2对韦兰胶的产量和粘度的影响。结果如图7所示，加入量超过0.5%后，发酵70h后，发酵液中没有胶物质产生且发酵液仍澄清。这表明加入的量过大不只会抑制韦兰胶的合成也会影响菌体的生存繁殖。控制加入量在0.075%以内，随着加入量的增加，产量有小幅度的增加，粘度值影响不甚明显，加入的H2O2为0.075%时，韦兰胶产量提高的最明显，提高率为16.42%。
【权利要求】
1.用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂，所述的携氧剂为表面活性剂类携氧剂TritonX-100、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80。
2.如权利要求1所述的表面活性剂类携氧剂在韦兰胶发酵中的应用，其特征在于，发酵初期，在发酵培养基中分别添加0.05% (m/v)的TritonX-100、0.2% (m/v)的Tween-20、0.2% (m/v)的Tween-40或0.3% (m/v)的Tween-80,能使韦兰胶的产量分别提高21.80%、22.73%、36.62% 和 28.12%。
3.根据权利要求2中所述表面活性剂类携氧剂的应用，其特征在于所述发酵培养基的组成为(m/v):蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaNO34g/L,MgSO4 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L、ZnSO4 0.01mmol/L,MnCl2 0.0lmmol/L 和NiSO4 0.02mmol/L构成的.微量元素溶液lmL。
【文档编号】C12R1/01GK103468762SQ201310440981
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】马挺, 李国强, 罗影, 吴萌萌, 周洁芳 申请人:南开大学