专利名称：：酶促制备香茅醛的方法酴&制备香茅醛的方法本发明涉及从a，/-不饱和醛类制备旋光饱和酪类或醇类的除淀方法，尤其是制备香茅搭的方法。发明背景(R)-(+)香茅醛是重要的化学中间体，其例如可用于制备薄荷醇。化学法制备(R)-(+)香茅醛，始于柠檬醛，需要非常复杂的方法(隔绝氧和7JC)，这导致工业合成的成^f艮高。发明目的目的是提供通过对应选择性还原柠檬醛制备香茅醛的方法，该方法提供了高化学产率且拥有最大对映体纯度的香茅醛。发明描述本发明涉及在烯醇还原酶的存在下通过还原从式(l)的a，P-不饱和窿类制备式(2)的旋光饱和醛类或醇类的过程。所述烯醇还原酶(i)具有多肽序列SEQIDNo.l或2,或(ii)具有与SEQIDNo.l或2的序列至少80%同一的多肽序列。(1)(2)其中，Rl和R2分别独立地为H、CrCr烷基，R3为H、d-CV烷基或烯基，以支链和直链形式。本发明方法可使用式(l)的a，p-不饱和醛类实现，在所述式1中Rl和R2分别独立地为H、支链和直链形式的d-Cr烷基，R3为H、支链和直链形式的d-CV烷基或烯基。烷基和烯基可以是单或多取代的。本发明的方法特别适宜的底物是式(l)的那些a，(5-不饱和醛类，其中Rl为H，R2为CH3且R3为-<:112-<:112-<:11=(<:113)2(顺式或反式柠檬醛)；以及其中Rl为CH3,R2为H且R3为013(2-甲基-戊-2-烯-1-醛)的那些。本发明所采用的烯醇还原酶，偶尔且在某种程度上，也会除了将a^官能团的a，j5位中的双键还原之外，还原所述羰基官能团自身，以在该情况中产生相应的醇。适用于本发明方法的烯醇还原酶，是能够在NADPH依赖的反应中将2-曱基-戊-2-烯-l-醛还原以提供(S)-2-甲基-戊烷-l-醛的酶。该反应在下文中也净皮称作纟莫式反应。此外，本发明方法中适合的烯醇还原酶具有如SEQIDNo.l或No.2的多肽序列，或与SEQIDNo.l或2的序列为至少80。/n、优选至少90%、特别优选至少95%、以及尤其是至少97%、98%或99%同一的多肽序列。具有SEQIDNo.l的多肽是来自贝克酵母菌中的QYE2基因(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因座YHR179W)。具有SEQIDNo.2的多肽是来自贝克酵母菌中的QYE3基因(酿酒酵母基因座YPL171C)。为了本文描迷的目的，序列同一性由威斯康星大学(UniversityofWisconsin)遗传计算机组(GeneticsComputerGroup,GCG)的计算;^^呈序"GAP"确定，采用10.3版本和GCG推荐的标准参数。从SEQIDNo.l或2开始，此类烯醇还原酶可以通过技术人员已知的特定或随机诱变过程得到。但是可选的，也可以就烯醇还原酶筛选樣史生物，特别是以下属的那些J/&/^HWie//<i、交替球菌属^4/r^w^cc"^、匈wa附owas、Ji7im'co/a、杀雄菌属(14rsewo!p^wi/s)、々Wv/rg"、丑rewwm'a、布赫纳氏菌属0"cA/iWtf)(蜂虫P-内共生体)，布戴约维采菌属OB"i/v/c/a)、布丘氏菌属^B"故ViMx:e,/a)、C""編fl似s尸A/o附ofettctef，西地西菌属(CW"^1)、柠檬酸细菌属(OY/Y^""w),D/cA:^^,爱德华氏菌属、肠杆菌属(五"fe/vAacter),欧文氏菌属(jE"nv/"/ff)，埃希氏菌属(jE^c/rer/c/f/")，爱文菌哉￡"卿>^//")，GW附o"/e〃"，哈夫尼菌属(^(/>|/")，克雷伯氏菌属(1&^>//")，克吕'沃尔菌属(iO"3;vwfl)，勒克菌属(JLec/e,c/a)，勒米《若菌属(/^>)/^//")、米勒菌属(Af(CerC/a)，摩根菌属(Mof^awe/Za)，月巴軒菌属((76esM/w6flcte"M附)，泛菌属(尸flwtoea》果股軒菌属(尸ec似Aflcten'M附),发光軒菌属(jP/w似r/raAdMs),邻单胞菌属(/YesiV附o"fls),布拉格菌属(iV"g/fl)、^承并,4(尸w紐附)，普罗威登斯菌属(/VoviVfew"Vi)，#,感、拉乌尔菌属(K朋"/feWa)、沙门菌氏属(S"/附owe//^、沙门菌属(S"wso"/fl)，沙雷氏菌属(Seira""),志贺氏菌属(^/^^//")、、塔特姆菌属(r"似附e,/fl)、7hiAw/wW/flr、ff7gg/esMW^/"、致病杆菌属(JVTewof^"^/附)，耶尔森氏菌属(!^,'/|/");^约克菌属(1^^^//<1)，所述烯醇还原酶催化上述模式反应，且其M酸序列已经具有所需的与SEQNo.l或2的序列同一性或其通过诱变过程得到。所述烯醇还原酶可以以纯化或部分纯化的形式或者另外以;微生物本身的形式4吏用。从微生物中回收和纯化脱氢酶的方法是技术人员充分了解的。用所述烯醇还原酶的对映选择性还原优选在合适的辅因子(也叫做协同底物)的存在下进行。还原酮常用的辅因子是NADH和/或NADPH。此外，也可以将烯醇还原酶用作天然包含辅因子的细胞系统，或添加可选的氧化还原介体(A.Schmidt,F.Hollmann和B.Biihler"OxidationofAlcohols"inK.Drauz和H.Waldmann，EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis2002,第III巻，991-1032,Wiley-VCH，Weinheim)。更加优选在合适还原剂的存在下用所述烯醇还原酶实现对映选择性还原，所述还原剂再生在所述还原过程中被氧化的辅因子。合适还原剂的实例有糖类，特别是己糖，例如葡萄糖、甘露糖、果糖，和/或可被氧化的醇类，特别是乙醇、丙醇或异丙醇，也可以是甲酸盐、亚磷酸盐或氢分子。为了氧化还原剂并与^目关地再生辅酶，可以添加第二种脱氢酶，例如，若使用的还原剂是葡萄糖，那么添加葡萄糖脱氢酶；或者如果使用的还原剂是甲酸盐，那么添加甲酸脱氢酶。所述的第二种脱氬酶可以作为游离或固定化的酶，或者以游离或固定化细胞的形式使用。其制备可以分别进行，也可以通过在(重组)还原酶菌林中共表达来进行。所述方法的优选实施方案是通过酶促系统再生辅因子，在所述系统中使用第二种脱氢酶，特别优选是葡萄糖脱氢酶。本发明另外涉及烯醇还原酶用于制M茅醛的用途。在此实施方案中使用的优选的辅因子分别是NAD+和NADP+，其可以通过合适的协同底物(氧化剂)再次再生。这里可以使用的优选的协同底物是丙酮，其与已经存在的ADH和/或额外使用的脱氢酶一起，再生辅因子并在该过程中被还原为异丙醇。为了本发明的目的，"对映选择性"意思是根据下式以已知方式计算的S对映体的对映体过量(enantiomerexcess,ee)(以o/o):ee(。A)-S-对映体-R-对映体/(S-对映体-R-对映体)xlOO是至少80%,优选至少90%,特别是至少95%以及尤其是至少97%。根据本发明使用的烯醇还原酶可以游离形式或固定化形式使用。固定化酶表示固定在惰性支持物上的酶。合适的支持材料和在其上固定的酶公开于EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-A100193773，以及这些专利里引用的参考文献中。在这个问题上，引用的参考文献是其整体引入这些出版物的公开中。合适支持材料的实例包括粘土、粘土矿物例如诸如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钩、纤维素粉、阴离子交换材料，合成聚合物诸如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃诸如聚乙烯和聚丙烯。支持材料常常以细分的颗粒形式用于制备受支持的酶，优选提供多孔形式。支持材料的颗粒大小一般不大于5mm，特别是不大于2mm(筛级(sievegrade))。类似地，当使用脱氢酶作为整个细胞催化剂时，可以选用游离或固定化形式。支持材料的实例是藻酸4丐和角叉藻聚糖。酶和细胞也可以直接与戊二醛交联(交联以得到CLEA)。例如，相应的和其他固定化方法在J.Lalonde和A.Margolin的"ImmobilizationofEnzymes"inK.Drauz和H.Waldmann，EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis2002,第III巻，991-1032，Wiley-VCH,Weinheim中有描述。反应可以在水性或非水性反应介质中，或在2相体系中，或在(微)乳剂中进行。水性反应介质优选是緩沖溶液，其通常具有从4到8的pH,优选从5到8。除水之外，水性溶剂也可以包含至少一种醇，例如乙醇或异丙醇或二甲基亚砜。非水性反应介质指基于反应介质的总质量，包含小于1%(重量)，优选小于0.5%(重量)的水的反应介质。该反应优选在有机溶剂中进行。适宜溶剂的实例;O旨族烃，其优选具有5至8个碳原子，如戊烷，环戊烷，己烷，环己烷，庚烷，辛烷或环辛烷；卣代脂族烃，其优选具有一个或两个碳原子，如二氯曱烷，氯仿，四氯化碳，二氯乙烷或四氯乙烷；芳烃，如苯，甲苯，二曱苯，氯苯或二氯苯；脂族无环和环的醚类或醇类，其优选具有4至8个碳原子，如乙醚，甲基叔丁基醚，乙基叔丁基醚，二丙醚，二异丙醚，二丁基醚，四氢呋喃；或酯类，如乙酸乙酯或乙酸正丁酯；或酮类，如甲基异丁基酮或二恶烷或其混合物。特别优选是使用上述醚类，尤其是四氢呋喃。用烯醇还原酶的还原优选在7jc性-有机，特别是水性，反应介质中进行。S^l还原中使用的底物(l)优选浓度是从0.1g/l到500g/l，特别优选是从lg/1到50g/l,并且可以随后连续或分批添加。Sl^还原通常在反应温度低于所使用的还原酶的灭活温度并高于-10。C下进行。所述温度特别优选是从0到100。C的范围内，特别是从15到6(fC，且尤其是从20到40°C，例如大约30。C。该步骤可以涉及，例如，最初向底物(l)引入烯醇还原酶、溶剂，以及(根据需要)辅酶；根据需要引入第二种脱氢酶以便再生所述辅酶；和/或还有还原剂并混合混合物，例如通过搅拌或摇晃。但是，也可以将该还原酶固定在反应器中，例如在柱子中并引导包含底物以及根据需要辅酶和/或协同底物的混合物通过反应器。为此目的，混合物可以在反应器中循环，直到达到所需的转化率。在该过程中，羰基官能团的a,p位双键被还原为单键；偶然地，皿官能团本身被还原为醇官能团。基于混合物中存在的底物，通常进行还原达到转化率至少为70%，特别优选至少85%，且尤其是至少为95%.反应的过程，也就是，双键的顺序还原，可以通过常规手段进行监控，比如说气相色谦或高压液相色谱。具>^〉开的酶的"功能等价物"或类似物为了本发明的目的，是指与之不同且还具有所需生物活性比如底物特异性的多肽。因此，例如，"功能等价物"指这样的酶，其催化模式反应，并具有包含SEQIDNo.l或2所列出的任意^J^酸序列的酶活性的至少20%，优选50%,特别优选75%，非常特别优选90%。此外，功能等价物优选在pH4到IO之间稳定，且有利地具有pH最优在5到8之间且温度最优在20。C到80°C的范围内。根据本发明，"功能等价物"特别还指突变体，其在上述JL^,列的至少一个序列位置中具有并非是特定提到的那一个的氨基酸，但是其仍然具有上述生物学活性之一。"功能等价物"因此包含通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体，任何序列位置上发生所述修饰都是可能的，只要它们产生的突变体拥有本发明的性质。如果突变体和未修饰的多肽之间的反应性模式定性地相对应(即例如相同底物以不同的速率反应)，功能等价性也是特别存在的。合适的M酸取代实例可在下表中找到<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述含义中的"功能等价物"也是所描述多肽的"前体"且也是"功能衍生物"。在此上下文中，"前体，，是多肽的天然或合成的前体，其具有或不具有所需的生物学活性。本发明中多肽的"功能衍生物"同样可以在已知技术的帮助下，在功能性M酸侧基或其N端或其C端上制备。此类衍生物包含，例如羧g团的脂族酯，羧睃基团的酰胺，该酰胺通过与氨或与伯胺或仲胺反应得到；游离氨基的N-酰基衍生物，该衍生物通过与酰基反应制备；或游离羟基的O-酰基t汴生物，该衍生物通过与酰基反应制备。在可能的蛋白质糖基化情形中，本发明的"功能等价物"包含上述类型的去糖基化或糖基化形式的蛋白质，也包含通过改变糖基化模式得到的修饰的形式。"功能等价物，，天然还包含从其他生物获得的多肽以及还有天然存在的变体。例如，同源序列区的区域可以通过序列比较确立，而等价酶可以基于本发明特定的指导确定。"功能等价物"同样包含本发明多肽的片断，优选单个域或序列基序，例如该片段具有所需的生物学功能。"功能等价物"此外还是融合蛋白质，其包含任何所述多肽序列或由此衍生的功能等价物，以及至少一个另外的异源序列，所述异源序列与之功能不同且是N-末端或C-末端功能性连接的(即，无任何实质的融合蛋白质部分的互相功能损害)。例如，此类异源序列的非限制性实例是信号肽或酶。本发明中蛋白质的同源物可以通过筛选诸如截短突变体的突变体组合文库鉴别。例如，多种蛋白质变体文库可以通过核酸水平的组合诱变生成，例如通过S^1连接合成的寡核苷酸混合物。有大量的方法可用于从简并的寡核苷酸序列制备潜在同源物文库。简并的基因序列可以在DNA合成仪中化学合成，然后将合成的基因连接到合适的表达载体中。使用简并的基因集合4吏得在混合物中提供所有的序列成为可能，所迷序列编码所需的潜在蛋白质序列集合。合成简并的寡核苷酸的方法已为技术人员所知(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人，(1984)Science198:1056;Ike等人(1983)NucleicAcidsRes.11:477).篩选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物以及筛选具有所选择性质的基因产物的cDNA文库的多种技术在现有技术中是已知的。可将这些技术修改以用于快速篩选基因文库，所述基因文库是通过本发明同源物的组合诱变生成的。篩选进行高通量分析的大基因文库的最常用技术包括将基因文库克隆进可复制的表达载体，将合适的细胞用得到的载体文库转化并在一定条件下表达组合基因，在所述条件下所需活性的检测促进了10编码其产物被检测的基因的载体的分离。循环集团诱变(Recursiveensemblemutagenesis,REM)是增加文库中功能性突变体的频率的技术，可以同筛选测试组合以便鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等人(1993)ProteinEngineering6(3):327國331)。本发明还涉及核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其编码具有本发明还原酶活性的酶。优选提供这样的核酸序列，其编码例如根据SEQIDNo.l或2的M酸序列或其特征部分序列。本文提及的所有核酸序列可以本身已知的方式通过化学合成从核苷酸构件制备，例如通过个体重叠、双螺旋的互补核酸构件的片段浓缩。寡核酸可以，例如，4吏用phosphoamidite方法以已知方式化学合成(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896-897页)。借助于DNA聚合酶克列诺片段和连接反应的合成寡核苷酸的装配和缺口填充以及还有一般的克隆方法在Sambrook等人(1989)的MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress有描述。实施本发明的S^还原方法的另外的实施方案烯醇还原酶在本发明的方法中可以用作游离或固定化酶。本发明的方法有利地在0。C到95。C间，优选是在10。C到85。C之间，特别优选是在15。C到75。C之间的温度下进行。在本发明方法中，有利保持pH在4到12之间，优选是在pH4.5到9之间，特别优选在pH5到8之间。在本发明方法中，对映纯的或手性产物(2)指的是表现出对映体富集的对映体。在本方法中优选实现至少为70。/。ee,优选至少为80。/。ee，特别优选至少90。/。ee,非常特别优选至少98。/。ee的对映体纯度。本发明的方法可以使用生长细胞，该生长细胞包含本发明中的核酸，核酸构建物或载体。也可以使用静息细胞或破裂的细胞。破裂的细胞指，例如，通过用溶剂处理变得可透过的细胞，或者例如通过用酶处理、通过机械处理(例如弗细胞压碎器或超声波处理)或通过其他方法被破裂的细胞。用这种方式获得的粗提取物有利地适于本发明的方法。对于该方法还可以使用纯化的或部分纯化的酶。已经有利地应用于反应的固定化的微生物或酶同样也是合适的。本发明的方法可以分批、半分批或连续操作。该方法可以有利地在生物反应器中进行，例如，在Rehm等人编著(1993)的Biotechnology第二版第三巻中，特别是第二章中所描述的。下述实施例通过举例的方法描述但不限定本发明。在此背景中，参考附图，其中实验部分用酿酒酵母的2-曱基-戊-2-烯-l-醛的生物转化生物转化是在有挡板的500ml的锥形瓶中进行的。所述烧g每种情形中装有126ml的转化溶液。为此，每种情形中加入21g的D-葡萄糖。调节所需的pH(6和8.5之间)。每个烧瓶的底物量是200mg的2-甲基戊-2-烯-l-醛。通过添加21g的贝克酵母起始实验，并且将反应混合物置于培养箱(处于所需温度下(28和3"C之间)(以240rpra摇动))中。于6、U、l8、24、36和48小时后取出样品并通过气相色镨分析。在pH7.5和pH8.5之间达到最高转化率(40-70%)。在pH=8.5且T=37。C时，光学纯度为ee=92.1，转化率为66.6%。用酿酒酵母的柠檬醛的生物转化生物转化是在有挡板的500ml的锥形瓶中进行的。所述烧瓶在每种情形中装有126ml的转化溶液。为此，在每种情形中添加21g的D-葡萄糖。调节所需的pH(6和8.5之间)。每个烧瓶的底物量是210mg的柠檬醛(柠檬醛为70:30顺式/反式混合物)。通过添加21g的贝克酵母起始实验，并且将反应混合物置于培养箱(处于所需温度下(28和37。C之间)(以240rpm摇动))中。于6、12、18、24、36和48小时后取出样品并通过气相色谦分析。除(R)-(+)香茅醛之外，还得到了(RM+)-B-香茅醛以及橙花醇和香叶醇。53.4g的Na2HP04和21g的D-葡萄糖，以及126ml的蒸馏7JC(pH调整到6和8.5之间)。权利要求1.在烯醇还原酶的存在中通过还原从式(1)的α，β-不饱和醛类制备式(2)的旋光饱和醛类或醇类的方法，所述烯醇还原酶(i)具有多肽序列SEQIDNo.1或2，或(ii)具有与SEQIDNo.1或2的序列有至少80％同一的多肽序列，其中，R1和R2分别独立地为H、C1-C4-烷基，R3为H、C1-C6-烷基或烯基，以支链和直链形式。2.根据权利要求1的方法，其中还原使用NADPH作为辅因子进行。3.根据权利要求l的方法，其中S^1再生所使用的辅因子。4.根据权利要求l的方法，其中通过葡萄糖脱氢酶再生辅因子。5.根据权利要求l的方法，其中还原在水性系统中进行。6.根据权利要求l的方法，其中烯醇还原酶以固定化形式存在。7.烯醇还原酶在用于从柠檬醛制备(R)-(+)香茅醛的方法中的用途，所述烯醇还原酶(i)具有多肽序列SEQIDNo.l或2,或(ii)具有与SEQIDNo.l或2的序列至少80。/。同一的多肽序列。全文摘要在烯醇还原酶的存在下，通过还原从式(1)的α，β-不饱和醛类制备式(2)的旋光饱和醛类或醇类的方法，所述烯醇还原酶(i)具有多肽序列SEQIDNo.1或2，或(ii)具有与SEQIDNo.1或No.2所示有至少80％序列同一性的多肽序列。文档编号C12P7/24GK101331233SQ200680046937公开日2008年12月24日申请日期2006年12月19日优先权日2005年12月30日发明者A·沙德勒,R·施蒂默尔,S·林克-杨科,T·弗里德里希申请人:巴斯夫欧洲公司