专利名称：用于催化柠檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种基因工程菌及其构建方法，更具体 地说，涉及一种用于生物催化柠檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其构建方法。
背景技术：
香茅醛是一种重要的单离香料，广泛用于饮料、糖果、食品等的加香和其它香精的配 帝lj,还是合成其它香料的原料。工业上主要由香茅油、桉树油等精油中分离得到。也可以 通过柠檬醛催化加氢或以e -香茅醇加氢制得。
微生物催化柠檬醛加氢生成香茅醛的反应式如下
其机理是利用微生物代谢中产生的氧化还原酶选择性的催化加氢。反应过程中需要辅酶 NADH (还原型辅酶I )的参与，生成NAD+ (氧化型辅酶I )。利用生物转化法催化柠 檬醛加氢生成香茅醛与其他方法相比具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、转化 率高、生产工艺简单和副产物少等优点。
虽然国外有关于利用微生物催化柠檬醛加氢生成香茅醛的文献，但国内没有相关的文 献和专利报道，而且现有的微生物催化柠檬醛加氢生成香茅醛中所使用的微生物均为野生 菌，尚无利用基因工程菌催化柠檬醛加氢生成香茅醛的报道，因此，有必要对此进行研究。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种NADH氧化酶的重组表达质粒，能够转化基因工程 菌以表达NADH氧化酶。
本发明的第二个目的在于提供所述重组表达质粒的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供一种基因工程菌，能够表达NADH氧化酶。 本发明的第四个目的在于提供所述基因工程菌的构建方法。 本发明的第五个目的在于提供一种生物催化柠檬醛生成香茅醛的方法。 本发明的重组表达质粒是在合适的表达载体上克隆有NADH氧化酶基因gye。 根据本发明，所述NADH氧化酶基因gye可以来源于以下菌中的任一种大肠杆菌 (&c/2m,c/H'flfco/Z)、志贺菌(幼扭〃a)、沙门氏菌(S"/mowe〃a)、酉昔杆菌"c咖6a"er)、
克雷伯氏菌(G/wco朋6a"e。；优选的，所述NADH氧化酶基因gye来源于氧化葡萄糖酸
杆菌(G/wcowo^acte/- oxj^my)。
根据本发明，所述NADH氧化酶基因g^具有SEQ ID NO.l所示的序列。
根据本发明，所述表达载体为pET系列表达载体，优选的，所述表达载体为采用pET28。
本发明的重组表达质粒的构建方法包括以下步骤
A、 扩增编码NADH氧化酶的基因g^的序列；
B、 将扩增获得的NADH氧化酶基因gye序列经酶切后，连入经相同酶切的pET系列表 达载体中，获得NADH氧化酶的重组表达载体。
本发明的基因工程菌株转化有上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重组表达质粒。 本发明的基因工程菌株的构建方法包括将上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重组表 达质粒转入宿主菌，获得表达NADH氧化酶的基因工程菌。
根据本发明，所述基因工程菌为大肠杆菌，优选的，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21。 本发明的生物催化柠檬醛生成香茅醛的方法，包括以下步骤
A、 发酵所述基因工程菌以表达NADH氧化酶；
B、 向发酵液中加入底物柠檬醛，通过NADH氧化酶催化加氢获得香茅醛。 将获得的基因工程菌进行发酵，向发酵液中加入底物柠檬醛，溶液，获得香茅醛。 本发明开辟了利用基因工程菌生产香茅醛的先例，使得普通大肠杆菌具备了催化柠檬
醛生成香茅醛的功能，这为今后构建生产香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也为进一 步获得更为优化的工程菌奠定了基础。
图1为基因工程菌BL21/gye的发酵表达产物经纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中泳 道l为经过His-Tag柱纯化后的GYE蛋白；泳道2为表达后没有纯化的破壁上清液；泳 道3为蛋白标准分子量；泳道4为没有重组的BL21的破壁上清液。
图2显示了基因工程菌BL21/gye表达的NADH氧化酶催化柠檬醛后的产物质谱图。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验
室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或者制造 商建议的条件进行或配置。
本发明的实施例中使用的大肠杆菌BL21及pET系列表达载体pET28均购自Novagen公司。
本发明的实施例中使用的细菌DNA抽提试剂盒购自北京博大泰克生物技术有限公司。
实施例1、基因工程菌的构建
1.1、 引物设计
根据NCBI Genbank中NADH氧化酶的基因gye的序列，设计扩增gye基因的PCR 引物Pgye-1和Pgye-2序列如下
Pgye-1: 5，- CGACATATGCCAACCCTGTTCGATC -3'; Pgye-2: 5，- TTAGAATTCTCAGTTGGGGCCGGAGGTG -3，。
为了便于与表达载体的酶切连接，弓l物Pgye-1上引入I酶切位点，弓l物Pgye-2 上引入5coRI酶切位点，所述酶切位点分别如序列中下划线所示。
1.2、 基因gye的克隆
用细菌DNA抽提试剂盒获得氧化葡萄糖酸杆菌(DSM2003)总DNA，并以其为模 板，Pgye-1和Pgye-2作为引物，PCR扩增^Z/ 基因，具体条件如下
反应体系氧化葡萄糖酸杆菌总DNA (0.02mg/nl) 1^1 ，引物Pgye-1 (20nmol/L) 和Pgye-2 (20pmol/L)各lpl， dNTP (1.6腿ol/L) 4pl,Taq酶l.Ounits， 10XTaq buffer (2.0mmol/L) 5pl,加双蒸水至50pl。
反应条件95°C 5min; 95°C 45s， 55°C 45s， 72°C 80s完成30个循环；最后72。C延 伸10min。
PCR产物经1X的琼脂糖电泳检测，回收得到大小约为l.lkb的片断，经测序，确定 为NADH氧化酶基因gye的DNA序列。 1.3、 表达载体的构建
将回收的片段以Mfc I、 ￡coR I酶切，然后与同样经Msfe I、 ￡coR I酶切的pET28载体 连接，得到重组表达质粒，命名为pET-gye。
得到的重组表达质粒pET-gye经酶切鉴定，符合预期结果。
最后对鉴定为正确的重组表达质粒pET-gye进行测序，测序结果显示，克隆入表达载 体的NADH氧化酶基因gye的序列如SEQ ID NO:l所示。
1.4、 基因工程菌的构建
使用常规方法将以上获得的重组质粒pET-gye转化大肠杆菌BL2I,获得基因工程菌 BL21/gye，通过测序验证该重组质粒构建正确。
实施例2、基因工程菌发酵表达及产物检测
2.1、 基因工程菌BL21/gye的发酵表达与纯化
将实施例1获得的基因工程菌BL21/gye接种入LB培养基中，于37"C培养至对数 生长期，加入IPTG至终浓度lmmol/L，继续培养6小时。
离心收集菌体，超声破菌，离心收集上清，用His-Tag亲和柱纯化，得到的纯化产物 进行SDS-PAGE电泳，结果如图l所示，可见在40kDa处得到清晰条带，与预期NADH 氧化酶条带大小相符，证明构建的基因工程菌BL21/gye能够发酵表达NADH氧化酶。
2.2、 发酵产物检测
将以上获得的纯化的NADH氧化酶蛋白加入反应液(5Ommol/L磷酸缓冲液1.4mL、 乙腈0.3ml、 100mmol/LNADH溶液0.3ml、柠檬醛2.5nL)中催化反应，于37t:， 100rpm 下反应4h，产物经液质方法鉴定，结果如图2所示，可见获得的产物为香茅醛，表明本 发明的基因工程菌BL21/gye表达获得的NADH氧化酶能够催化柠檬醛加氢生成香茅醛。
实施例3、利用基因工程菌BL21/gye生产香茅醛 本实施例中使用的菌种为实施例1获得的基因工程菌BL21/gye。 本实施例中使用的培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，卡那
霉素0.05g/L, pH7.0。
将基因工程菌BL21/gye接入装有200mL培养基的500mL摇瓶中，于37°C 、 250 rpm
培养，定时取样检测OD65o值，当0065()为0.4日寸，添加IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱
导培养14小时。
向摇瓶中加入柠檬醛至终浓度为重量体积比10%，加入乙腈至终浓度为10% (重量 体积比)，于35。C、 250rpm反应4h。
取反应液，用氯仿萃取分离纯化获得香茅醛，测定采用气相色谱(GC)分析方法， 色谱仪的操作条件如下
色谱型号安捷伦6820
色谱柱DB-WAX (30mX0.53mmXl.0pm)
色谱工作站Sepu3000 (杭州普惠科学仪器有限公司)
载气氮气
流速1 ml/min 进样量0.5 |ll 分流比10:1
检测器氢火焰检测器(FID)
柱温100。C保持2分钟，然后以2(TC/min梯度升温至22(TC 进样口温度25CTC 检测器温度280°C
以l， 4-丁二醇为内标，用内标法定量。
根据GC图谱峰面积法，计算得到拧檬醛转化率达到75% 。
虽然以上实施例仅以来源于氧化葡萄糖酸杆菌(G/wco"o6ac^"o;c^tora)的NADH氧 化酶基因序列为例进行了说明，但本发明的重组表达质粒以及构建的基因工程菌 pET-gye中的NADH氧化酶基因gye并不局限于氧化葡萄糖酸杆菌(G/wco"o6ac敏 ox少6fam)来源的NADH氧化酶基因，根据本发明的教导，结合现有技术，本技术领域的 技术人员可以使用来源于其它菌种，如大肠杆菌(&c/^Wc/^co//)、志贺菌(幼/ge〃a)、 沙门氏菌(&/wo"e//a)、醋杆菌"cetoZ)a"w)、克雷伯氏菌(G/wco"oZ^"")等的NADH 氧化酶基因构建重组表达质粒，进而构建能够表达具有NADH氧化酶活性的蛋白，这是 显而易见的，因此同样应当属于本发明的范围。
综上所述，本发明提供了一种全新的基因工程菌用于生产香茅醛，利用NADH氧化 酶基因表达产物NADH氧化酶选择性催化柠檬醛加氢生成香茅醛，不仅生产工艺简 单，而且转化率较高。同时，本发明也开辟了利用基因工程菌生产香茅醛的先例，使得普 通大肠杆菌具备了催化柠檬醛加氢生成香茅醛的功能，这为今后构建生产香茅醛的基因工 程菌提供了新的思路，也为进一步获得更为优化的工程菌奠定了基础。序列表
〈110〉华东理工大学
〈120〉用于催化柠檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其构建方法
〈130〉 P5071094 〈160〉 1
〈170> Patentln version 3.1
〈210〉 1 〈211〉 1086 〈212〉 DNA
〈213〉 G/wcowZ a"w ox^am* 〈400〉 1
atgccaaccc tgttcgstcc cattgatttc ggtcccattc acgcg犯a^a ccggatcgtg 60
atgtccccgc tgacgcgcgg acgtgctgac aaggaggccg ttccgacccc catcatggcg 120
gaatactacg cccagcgcgc cagtgccggg ctgatcatca cggaagccac gggtatctcc 180
cgcgaaggtc tgggctggcc gttcgcaccg ggaatctggt ccgatgcgca ggtcgaagcc 240
tggaagccga tcgtggccgg tgtgcatgca aagggcggaa agatcgtctg ccagctctgg 300
cacatgggcc gcatggtcca ctcgtccgtg accggaacgc agcccgtctc gtcctccgcc 360
accacggccc ccggcgaggt ccatacctat gaaggcaaga agccgttcga gcaggcccgc 420
gcaatcgatg ccgcggatat cagccgtatt ctgaacgact atgagaacgc cgcccgcaat 480
gcgatccgcg ccggcttcga cggggtgcag atccacgccg ccaatggcta cctcatcgac 540
gagttcctgc gaaacggtac g幼tcaccgc acagatgaat acggcggcgt ccccgaaaac 600
cgcatccgtt tcctgaagga agtcaccgag cgcgtgatcg ctgccatcgg tgccgaccgc 660
acaggcgtgc gcctgtcccc caacggcgat acgcagggct gcatcgacag cgcacctgag 720
acggtctttg tcccggcggc aaagctgctt caggatctgg gcgtggcctg gctcgaactg 780
cgcgaacccg gcccg已已cgg caccttcggc
aagscgg3cc 8
agcccaaact gtccccgcag 840
atccgcaagg tgttcctgcg cccgctggtg c卿ccgcgc tggc卿agg g卿gctgat aaccccgacc tgccggagcg cttcgcccgc acctggtaca gtcagggccc cgaaggatac aactga
ctc犯tcagg actatacgtt cgaggcagca 900 gcgatcgcct tcggtcgcaa gttcatctcg 960 ggcatcgccc tgcagccgga tgatatgaaa 1020 acggactacc cgtccgccac ctccggcccc 1080
108权利要求
1、一种NADH氧化酶的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒是在一合适的载体上克隆有NADH氧化酶基因gye。
2、 如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述NADH氧化酶基因gye来 源于以下菌中的任一种氧化葡萄糖酸杆菌(G/wco"oZ)""er ox>Y/mw)、大肠杆菌(Esc/zen.c/z/a co//)、志贺菌(5%/ge〃a0、沙门氏菌(Sa/mcwe〃a)、醋杆菌(^ceto6fl"er)、 克雷伯氏菌(G7wco"o6""er)。
3、 如权利要求2所述的重组表达质粒，其特征在于，所述NADH氧化酶基因g^具 有SEQ ID NO:l所示的序列。
4、 如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述载体为pET系列表达载体。
5、 如权利要求1一4中任一项所述的重组表达质粒的构建方法，其特征在于包括以下 步骤A、 扩增编码NADH氧化酶的基因gye的序列；B、 将扩增获得的NADH氧化酶基因gye序列经酶切后，连入经相同酶切的pET系列 表达载体中，获得NADH氧化酶的重组表达载体。
6、 一种基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌转化有权利要求1一5中任一项所述 的重组表达质粒。
7、 如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21。
8、 如权利要求6—7中任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括将权 利要求l一5中任一项所述的重组表达质粒转入宿主菌，获得表达NADH氧化酶的基因工 程菌。
9、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21。
10、 一种生物催化柠檬醛生成香茅醛的方法，其特征在于包括以下步骤A、 对权利要求12—14中任一项所述的基因工程菌进行发酵以表达NADH氧化酶；B、 向发酵液中加入底物柠檬醛，通过NADH氧化酶催化加氢获得香茅醛。
全文摘要
本发明提供了一种用于催化柠檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其构建方法。本发明提供的重组表达质粒是在一合适的载体上克隆有NADH氧化酶基因gye，本发明提供的基因工程菌是在大肠杆菌中转化有该重组表达质粒。本发明提供了一种全新的基因工程菌用于生产香茅醛，利用NADH氧化酶基因gye表达产物NADH氧化酶选择性催化柠檬醛加氢生成香茅醛，简化了生产工艺，提高了生产效率。本发明开辟了利用基因工程菌生产香茅醛的先例，使得普通大肠杆菌具备了催化柠檬醛生成香茅醛的功能，这为今后构建生产香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也为进一步获得更为优化的工程菌奠定了基础。
文档编号C12N15/63GK101186924SQ200710171560
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者杨雪鹏, 波 殷, 马昱澍, 魏东芝, 魏国栋 申请人:华东理工大学