一种18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因的制作方法

专利名称：：一种18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种人乳头状瘤病毒衣壳蛋白基因，更具体地说，涉及一种18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因。
背景技术：
：全球每年有约50万妇女患宫颈癌(KoutskyLA.etal.EpidemiolRev1988:10:122-163)，其中约27万因宫颈癌死亡(80%以上在发展中国家)，宫颈癌发病率仅次于乳腺癌的。宫颈癌发病与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染有直接关系，采用灵敏的检测方法，可以从几乎100。/。的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。虽然，目前已经确定的HPV型超过100种，但在全世界范围内，约14%的宫颈癌患者由HPV-18感染引起。而且，由于HPV18与更具侵略性生长的癌有关并且在较温和的癌前病变(即CINWI)中很少发现，因此，开发抗HPV18感染的疫苗变得尤其必要。乳头状瘤病毒是一种DNA病毒，有两个后期基因病毒基因组的开放读码框架(ORF)，甩于编码病毒衣壳蛋白，分布被命名为L1和L2。其中，Ll蛋白是较大的衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，L2蛋白是较小的衣壳蛋白，在病毒壳粒中大多数L2蛋白在Ll蛋白内部，而且Ll的ORF在不同乳头状瘤病毒之间是高度保守的，而L2蛋白在不同乳头状瘤病毒之间几乎不保守，因此，开发宫颈癌疫苗时，针对衣壳蛋白U开发具有更好的针对性。同时，根据现有研究结果，Ll基因是一个好的免疫预防靶。在细菌中表达的L1蛋白或使用疫苗载体的Ll蛋白用于免疫，可保护动物不受病毒感染。在杆状病毒表达系统中表达乳头状瘤病毒L1基因中或使用疫苗载体导致组装成病毒样颗粒(VLPs)，该病毒样颗粒己经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答，因此，开发针对衣壳蛋白Ll的宫颈癌疫苗是可实现的。
发明内容本发明的一个目的在于，提供一种优化的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因，以用于开发宫颈癌疫苗。本发明还有一个目的在于，提供一种表达18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白Ll基因的毕赤酵母表达载体。3本发明还有一个目的在于，提供一种表达18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白Ll基因的毕赤酵母表达菌株。本发明还有一个目的在于，提供一种表达18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白Ll基因的毕赤酵母表达菌株的构建方法。本发明的第一个目的通过以下方法实现首先，对天然的HPV18L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出一个全新的HPVDNA序列；然后，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率的影响，避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正，例如将天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT;赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA;天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC;苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC;酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，甘氨酸(Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA，设计出两个全新的HPVDNA序列，并合成经过修正的全新的HPVDNA序列。本发明的第二个目的通过以下方法实现将合成的L1基因与毕赤酵母表达载体连接，从而构建HPV18L1基因的毕赤酵母表达载体。本发明的第三个目的通过以下方法实现将获得的上述毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母菌，从而构建HPV18L1毕赤酵母表达菌株。根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的HPV18L1蛋白为胞内表达蛋白。本发明提供的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白Ll基因是一种优化过的Ll基因，具有以下优点经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白而且能够满足工业化生产的要求；同时，由于采用毕赤酵母表达系统，因此成本低，产量高，且产品性质更加均一稳定。图1是pPICZ-18Ll载体构建示意图。图2是HPV18L1基因PCR扩增图。图3是pPICZ-18Ll载体鉴定图，其中，泳道1为经BstBI+Kpnl双酶切的pPICZaB;泳道2为BstBI+Kpnl双酶切的pPICZ-18Ll。图4是HPV18Ll表达Western-Blot鉴定结果图。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件进行。本发明的实施例中DNA延伸和PCR扩增，均采用购自Stratagene公司的热启动Pfu酶。本发明的实施例中，使用的pUC18质粒购自捷瑞公司，pPICZaB质粒购自Invitrogen公司。本发明的实施例中，使用的HPV18L1的VLPs的兔多抗由上海普欣生物技术有限公司制备，MAB885鼠单抗购自CHEMICON公司，HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京鼎国公司。本发明的实施例中，使用的BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。本发明的实施例中，纯化步骤中使用的清洗缓冲液配方为100mMPBpH7.0，0.15MNaCl;破菌缓冲液200mMMOPS，pH7.0，0.4MNaCl，0,05%Tween-80;实施例1、HPV18的密码子优化的L1基因的设计与合成1.1、HPV18的密码子优化的L1基因的设计本发明涉及经过毕赤酵母偏爱密码子优化的编码18型人乳头状瘤病毒(HPV18)主要衣壳蛋白LI的DNA分子，通过密码子最优化和对最优密码子频率进行一定修正获得三段DNA序列，其序列分别如SEQIDNO:l、2和3所示，具体如下首先，对天然的HPV18L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出一个全新的HPVDNA序列，即SEQIDNO:l。然后，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率的影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行一定的修正，例如将天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT，赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA，天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC，苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC，酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，甘氨酸(Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA，从而，设计出两个全新的HPVDNA序列，其中SEQIDNO:2是SEQIDNO:l序列中修正天冬酰胺(Asn)，赖氨酸(Lys)，天冬氨酸(Asp)这三个密码子所得的DNA序列；SEQIDNO:3是SEQIDNO:l序列中修正苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，甘氨酸(Gly)这三个密码子所得的DNA序列。1.2、HPV18的密码子优化的Ll基因的合成合成如序列SEQIDNO:l所示的HPV18的密码子优化的Ll基因，其所需的引物组共有引物36个，分别为引物181,182,183,184，185.186,187,188，189,1810,1811,1812，1813,1814,1815,1816，1817.1818,1819,1820，1821，1822，1823，1824,1825，1826，1827，簡，1829,1830,1831,1832,1833,1834.1835,1836上述引物序列分别如SEQIDNO:4-39所示，其中每4条用下划线相连的引物间形成一个互补群，可通过PCR构建寡聚体片段，并进而构建密码子优化的HPV18的Ll基因。具体构建方法如下1.2.1、寡聚体片段构建将引物互补对181，182，183和184的在5rC退火延伸IO个循环，获得PCR扩增用模板，接着，用相应的两侧引物181和184进行PCR扩增，将获得的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收获得大小约为200bp的目标片段(片段A)。同时，采用上述相同的方法，分别使用引物互补群185，186，187和188;189，1810，1811和1812;1813，1814，1815和1816;1817，1818，1819和1820;1821,1822，1823和1824;1825，1826，1827和1828;1829，1830，1831和1832;1833，1834，1835，1M^制备获得相应的寡聚体片段B，C，D，E，F，G，H和I。1.2.2、全长的密码子优化的HPV18L1基因构建分别将形成互补寡聚群的寡聚体(片段A，片段B，片段C和片段D;片段E，片段F,片段G，片段H和片段I)在5(TC退火延伸IO个循环，获得PCR扩增用模板，而后用相应的两侧引物(前一片段用引物181和1816，后一片段用引物1817和1836)进行PCR扩增，将获得的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收获得大小分别约为750bp和950bp的2个DNA片段，分别命名为片段J和片段K。再将上步获得的片段J和片段K在5rC退火延伸IO个循环，获得PCR扩增用模板，然后用引物al和a2作为引物，进行PCR扩增，引物al和a2序列如下所示al:5，-ATAGAATTCATGTGTTTGTACACTAGAGT-3';a2:5，-ATTGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3，。将获得的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，胶回收目标片段，获得大小约为1.7kbp的片段，并将该片段测序，该片段的序列测序结果如SEQIDNO:1所示，根据测序结果显示该片段即是全长的密码子优化的HPV18L1基因。获得的HPV18L1基因两端以EcoRl和Kpnl酶切位点装入pUC18质粒(捷瑞公司)中，命名为pUC-18Ll，并经测序验证为正确。按照类似的方法获得SEQIDNO:2和3所示的HPV18的密码子优化的Ll基因。为验证优化序列的可行性，下面以实施例1制备获得的HPV16L1基因优化序列中的一个(SEQIDNO:l)为例，构建表达质粒并验证其表达。实施例2、HPV18L1基因的表达载体构建将SEQIDNO:l的优化序列克隆到毕赤酵母表达载体中，构建方法如图1所示，具体步骤如下2.1、合成扩增HPV18L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示正向引物5，-TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3，；反向弓l物5,-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3，。其中，正向引物包括一个BstBI限制性内切酶位点；反向引物包括位于终止密码子侧翼的Kpnl限制性内切酶位点，所述酶切位点分别如引物序列中的下划线所示。2.2、用上述引物对为引物，以实施例l获得的pUC-18Ll'为模板，进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行电泳检测，结果如图2所示，证明获得了全长密码子优化的HPV18Ll基因；将扩增获得的PCR片段，经限制性内切核酸酶BstBI和KpnI双酶切消化，再与BstBI/Kpnl双酶切消化的pPICZaB(Invitrogen公司)连接。再用连接液转化大肠杆菌菌株ToplO(捷瑞公司)的感受态细胞，铺板于含25吗/ml零霉素的LB琼脂上。由于pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化细胞能够在含零霉素的LB培养基上生长。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒DNA，并经限制性图谱(结果如图3所示)和核苷酸序列分析检测HPV18L1基因和载体序列，鉴别出包含HPV18L1基因的正确构建体，命名为pPICZ-18Ll'，由于构建的质粒的分泌信号(a-factorsignal)已经被切去，因此，表达的HPV18L1蛋白应该是胞内表达蛋白。实施例3、HPV18L1基因的表达菌株构建和表达3.1、HPV18L1基因的表达菌株构建用SacI限制性内切酶单酶切pPICZ-18Ll，质粒使其线性化，对空质粒pPICZaB进行同样的酶切作为阴性对照。酶切反应液加入无水乙醇，获得DNA沉淀，用少量双蒸水溶解线性化的pPICZ-18Ll'片段，电击转化毕赤酵母菌X-33(Invitrogen公司)，电转化条件为DNA片段5微克，电压1500伏，电阻25欧姆，电击时间为5毫秒。电转化产物铺板于含200ug/ml零霉素(Zeocin)的YPDS琼脂上，由于pPICZaB载体上携带有零霉素抗性基因，因此转化产物能够在含零霉素的YPDS琼脂上生长。分离已转化细胞的单菌落，即为HPV18L1的毕赤酵母表达菌株。3.2、HPV18L1毕赤酵母表达菌株的表达将获得的HPV18L1毕赤酵母表达菌株接种至含1000ug/ml、1500ug/ml零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用4mlYPD液体培养基培养，24hr后换成BMMY培养基诱导基因表达，表达48hr后离心收获菌体。取一部分菌体破菌处理，破菌上清用West-Blotting鉴定，结果如图4所示，根据该图结果，破菌上清中有HPV18L1蛋白表达。虽然在本发明的实施例2和3中，使用的是SEQIDN0:1序列进行克隆和表达，但对于本领域的技术人员来说，使用SEQIDN0:2和3序列进行克隆和表达，以获得相似的结果是显而易见的，因此，属于本发明的保护范围；而且，根据本发明的构思，对于本领域的技术人员来说，构建相似的序列并利用该构建的序列，使用毕赤酵母进行克隆和表达以获得相似甚至更优的结果，也是显而易见的，因此，也属于本发明的保护范围。实施例4、HPV18L1蛋白检测以纯化的HPV18L1的VLPs做标准蛋白浓度曲线，以诱导前菌体做阴性对照，采用ELISA夹心法检测HPV18L1基因在毕赤酵母中发酵表达量，具体步骤如下用包被液2000倍稀释HPV18Ll的VLPs的兔多抗，向酶标板的凹孔中各加入O.lmL稀释后的兔多抗，于4。C过夜后，移去包被液，并用0.3mLPBST洗涤凹孔，然后用0.3mL封闭液于37"C保温2小时，进行封闭。用稀释液以对倍稀释的方式，将纯化的HPV18Ll的VLPs从浓度2pg/mL梯度稀释到0.0625ng/mL，同时将获得的发酵菌体的破菌上清分别稀释200倍，然后分别向凹孔中加入0.1mL梯度稀释后不同浓度的HPV18Ll的VLPs溶液或稀释后的破菌上清，于37'C保温1小时后，移去抗原液，并用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；然后用稀释缓冲液将MAB885鼠单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔各0.1mL，37'C保温1小时后，移去单抗溶液后，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；再向凹孔中加入用稀释缓冲液5000倍稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各O.lmL，在37'C保温0.5小时后，移去酶标液，并用0.3mL洗涤液洗涤凹孔后，向凹孔中各加入O.lmLDAB显色液，室温下作用20分钟后，向每个凹孔中加入0.05mL2MH2S04终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定OD45Q值。利用梯度稀释的HPV18L1的VLPs的OD45。的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算获得HPV18Ll蛋白的发酵表达量，结果如表l所示，其中用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如2pg/mL，1pg/mL，0.5吗/mL，0.25ng/mL，0.125ng/mL，作为标准浓度，通过ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应OD450检测值做橫坐标，建立标准线性回归方程。发酵破菌液上清稀释一系列倍数，例如50，100，200,400倍。测出的OD450值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为吗/mL)，再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为Hg/mL)。由于破菌液是由菌泥湿重破菌缓冲液-l:5配制的，所以发酵菌泥的目的蛋白表达量(单位为pg/g菌泥)为5X发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为iag/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌泥/L发酵液)，则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为pg/L发酵液)。发酵破菌液上清目的蛋白浓度(pg/mL)-稀释倍数X标准目的蛋白浓度(pg/mL)XOD45o(发酵破菌液上清)/OD45G(标准目的蛋白浓度)；发酵目的蛋白表达量浓度(pg/L发酵液)=5X发酵破菌液上清目的蛋白浓度(吗/mL)X发酵液菌体密度(g菌泥/L发酵液)。表l、VLPs发酵表达结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l的结果可见，本发明的HPV16L1蛋白基因的优化序列，不仅能够在毕赤酵母中表达HPV16L1蛋白，而且表达量较高，能够满足工业化生产的要求。实施例5、HPV18L1蛋白纯化将实施例3中制备的菌体破菌离心后，取破菌上清经过层析方法纯化，得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白，具体步骤如下将表达HPV18L1VLP的毕赤酵母细胞，按l:3加入清洗缓冲液混合，充分混匀，于8000rpm，离心5min，收集细胞，重复以上操作二遍。将清洗后的细胞按h5加入破菌缓冲液混合，充分混匀后，高压破碎以上细胞悬液，并重复操作，使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液，于9000rpm,30min，l(TC离心分离，收集离心上清。将经过离心澄清的破菌上清通过POROS50HS(AppliedBiosystems公司)层析柱进行初纯，洗脱方式为100%缓冲液A(0.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)至100。/o的缓冲液B(1.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Westem-blot检测。将含有HPV18L1蛋白的洗脱组分合并后，使用CHT(BIO-RADTypeII)层析柱精纯，洗脱方式为100%缓冲液A(20mMPB，0.6MNaCl，50mMMOPSpH76.5，0.05%Tween-80)至100。/。的缓冲液B(200mMPB,0.6MNaCl，pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测，将含有HPV18L1VLP的组分合并，即为最后的纯化样品，其纯度>90%。实施例6、HPV18L1疫苗制备参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将实施例5中纯化获得的Ll蛋白，吸附铝佐剂，制备获得具有极高的免疫原性的HPV18L1疫苗。实施例7、HPV18L1基因表达产物免疫原性的测定选取68周龄的SPF级BALB/c小鼠，分为4组，每组6只小鼠。第1组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲液(0.32M氯化钠,0.35mM硼酸钠，0.01%吐温-80，O.OIM组氨酸，pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)，其它3组分别用O.lmL浓度为5ng/mL、0.5吗/mL、0.05pg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组)，分别于第O、7、21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后两周采血。将采集得到的血液于37。C放置2h后，4000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20。C存放，并检测鼠血清的转阳率和滴度，具体方法如下用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV18L1至lpg/mL，向酶标板每个凹孔中各加0.1mL，4"C过夜。移去包被液，用0.3mLPBST洗涤凹孔。用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37'C保温2小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2X脱脂奶粉+PBST)以l:400稀释的被检血清(免疫过HPV18L1和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各O.lmL，于37"C保温1小时后移去血清液，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以l:5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各O.lmL，37。C保温0.5小时后移去酶标液，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔；然后向凹孔中加入O.lmLDAB显色液，室温避光作用20分钟后加2MH2SO40.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，OD450值如表2所示。表2、OD450读数鼠1鼠2鼠3鼠4鼠5鼠65ug免疫组1.2311.2081.2291.208l駕l掘0.5ug免疫组1.1501.2441.2271.1581.2521.1710.05ug免疫组1.4240.3571.1821.1011.1642.448铝佐剂组0.0870.2040.1550.1130.1430.100Cutoff值0.263Cutoff值为阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的OD45o值的平均值加上3倍标准差，0D45Q值大于Cut0ff值的小鼠判定为阳性，0D45Q值小于Cut0ff值的小鼠判定为阴性。三个检测组的转阳率结果如表3所示。表3、转阳率结果5ug/mL免疫组0.5ug/mL免疫组0.05ug/mL免疫组转阳率100%100%100%7.2、血清滴度的测定用包被液稀释纯化的HPV18Ll至lng/mL，取0.1mL加于酶标板的各凹孔中，4。C过夜；移去包被液，用0.3mLPBST洗涤上述凹孔，再用0.3mL封闭液(5X脱脂奶粉+PBST)于1137°C，保温封闭2小时。将被检血清(免疫过HPV18Ll的鼠血清)用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)采用对倍稀释方式，从l:500稀释度一直稀释到1:32000，阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)以l:IOOOO稀释，每个凹孔分别加入O.lmL稀释后血清(被检血清或阴性对照血清)，37'C保温1小时。移去血清液，用0.3mL洗涤液洗漆凹孔。每个凹孔加入用稀释缓冲液以l:5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG0.1mL，37'C保温0.5小时。移去酶标液后，用0.3mL洗涤液洗涤凹孔，并向凹孔中加入O.lmLDAB显色液，于室温作用20分钟后，加入2MH2SO40.05mL终止液终止反应。用酶标比色仪测定00450值。采用终点滴度法计算血清的滴度值，其结果如表4所示。表4、滴度测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>综上所述，本发明提供的18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白Ll基因是一种优化过的Ll基因，具有以下优点经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的18型人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成VLPs结构，纯化的VLPs吸附佐剂后，通过血清转阳率和血清滴度的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。序列表〈110〉上海惠生生物工程有限公司<120〉一种18型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因〈130〉P5071079<160>39〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉1707〈212〉DNA<213>毕赤酵母<400>1atgtgtttgtacac;tagagttttgattttgcactaccatttgttgcctttgtacggtcca60ttgtaccaccctcaaccattgcctttgcattccattttggtttacatggttcacattatc120atttgtggtcattacattattttgttcttgagaaacgttaacgttttcccaatcttcttg180caaatggctttgtggagaccttctgacaacactgtttacttgccacctccatccgttgct240agagttgttaacactgatgactacgttactagaacttctattttctaccacgctggttcc300tctagattgttgactgttggtaacccttactttagagttccagctggtggtggtaacaag360caagstattcctaaggtttccgcttaccaatacagagttttcagagttcaattgccagac420cctaacaagtttggtttgccagatacttctatttacaaccctgagactcaaagattggtt480tgggcttgtgctggtgttgaaattggt卿ggtcaaccattgggtgttggUtgtccggt540catcctttctacaacaagttggacgatactgagtcttcccacgctgctacttctaacgtt600tccgaagacgttagagataacgtttctgttgactacaagcaaactcaattgtgtattttg660ggttgtgctccagctattggtgagcattgggcta鄉gtactgcttgtaagtccagacct720ttgtctcaaggtgattgtccacctttggaattgaagaacactgttttggaggacggtgat780atggttgacactggttacggtgctatggatttctccactttgcaagacactaagtgtgaa840gttccattggatatttgtcaatctatttgtaagtaccctgactacttgcaaatgtccgct90013gatccatacggtgactctatgttcttttgtttgagaagagagcaattgttcgctagacac%0ttttggaacagsgctggtactatgggtgatactgttcctcaatccttgtacattaagggt1020actggtatgagagcttctccaggttcctgtgtttactctccttccccatctggttccatt1080gttacttctgactcccaattgttcaacaagccttactggttgcataaggctcaaggtcac1140aacaacggtgtttgttggcataaccaattgtttgttactgttgttgatactactagatcc1200actaacttgactatttgtgcttccactcaatctccagttcctggtcaatacgacgctact1260aagttcaagcaatactcc已gacacgttgaagsgtacgatttgcaattcatcttccaattg1320tgtactattactttgactgctgacgttatgtcttacattcattccatgaactcttccatt1380ttggaagattggaactttggtgttccacctccacctactacttctttggttgacacttac1440agattcgttcaMccgttgctattacttgtcaaaaggatgctgctccagctgagaacaag1500gacccttacgataagttgsagttttggaacgttgacttgasggaaaagttctctttggat1560ttggsccaatacccattgggtagaaagtttttggttcaagctggtttgagaagaaagcct1620actattggtccaagaaagagatccgctccttctgctactacttcctctaagccagctaag1680agagttagagttagagctagaaagtaa1707〈210〉2〈211〉1707〈212〉DNA<213〉毕赤酵母<400〉2atgtgtttgtacactgigagttttgattttgcsttaccatttgttgccattgtacggtccaGOttgtaccatccacaaccattgccattgcattctattttggtttacatggttcatattatt120atttgtggtcattacattattttgtttttgagaaatgttaatgtttttccaatttttttg180caaatggctttgtggagsccatctgacaatactgtttacttgccaccaccatctgttgct240agagttgtta已tactgacgactacgttactagaacttctattttttaccatgctggttct300tctagattgttgactgttggtaatccatactttagagttccagctggtggtggtaataaa360caagacattccaaaagtttctgcttaccaatacagagtttttagagttcaattgccagac420ccaaataaatttggtttgccagacacttcttgggcttgtgctggtgttgaaattggt卿catccattttac犯ta犯ttggacgacacttctgaagacgttagagacaatgtttctgttggttgtgcixcagctattggtgaacattggttgtctcaaggtgactgtccaccattggaaatggttgacactggttacggtgctatggacgttccattggacatttgtcaatctatttgtgacccatacggtgactctatgtttttttgtttttggaatagagctggtactatgggtgacactggtatgagagcttctccaggttcttgtgttacttctgactctc犯ttgtttaata犯aataatggtgtttgttggcat犯tcaattgactaatttgactatttgtgcttctactcaaaa3ttt3犯c^t3ctct￡tgax:atgttg犯tgtactattactttgactgctgacgttatgttggaagactggaattttggtgttccaccaagatttgttcaatctgttgctattacttgtgacccatacgacaaattgaaattttggaatttggacc犯tacccattgggtagaaaatttactattggtcc犯gaaaaagatctgctccaa^gtta^geigtt3g3gct3g犯犯taa〈210〉3〈211〉1707〈212〉DNAatttacaatccagaaactcaaagattggtt480ggtcaaccattgggtgttggtttgtctggt540gaatcttctcatgctgctacttctaatgtt600gactacaaaca犯ctc犯ttgtgtattttg660gctaaaggtactgcttgtaaatctagacca720ttgaaaaatactgttttggaagacggtgac780ttttctactttgcaagacactaaatgtg犯840aaatacccagactacttgcaaatgtctgct900ttgagaagagaacaattgtttgctagacat960actgttccacaatctttgtacattaaaggt1020gtttactctccatctccatctggttctatt1080ccatactggttgcataaagctc犯ggtcat1140tttgttactgttgttgacactactagatct1200tctccagttccaggtc犯tacgacgctact1260gaatacgacttgcaatttatttttcaattg1320tcttacattcattctatgaattcttctatt1380ccaccaactacttctttggttgacacttac1440caa已aagacgctgctcc已gctgaaaataaa1500gttg3cttg3犯g3犯3attttctttggac1560ttggttc犯gctggtttgagaagaaa^cca1620tctgctactacttcttctaaaccagctaaa16801707〈213〉毕赤酵母<400〉3atgtgtttgtatactagagttttgattttgcattatcatttgttgccattgtatggaccaGOttgtatcatccacaaccattgccattgcattctattttggtttatatggttcatattatt120atttgtggacattatattattttgttcttgagaaacgttaacgttttcccaattttcttg180caaatggctttgtggagaccatctgataacactgtttatttgccaccsccatctgttgct240agagttgttaacactgatgattatgttactagaacttctattttctatcatgctggatct300tctagattgttgactgttggaaacccatatttcagagttccagctggaggaggaaac犯g360caagatattccaaaggtttctgcttatcetatatagagttttcagagttcaattgccagat420cca^3caagttcggattgccagatacttctatttat犯cccagaaactcsaagattggtt480tgggcttgtgctggagttgaaattgga卿ggac犯ccattgggagttggattgtctgga>540catccattctataacaagttggatgatactgaatcttctcatgctgctacttctaacgtt600tctgaagatgttagagataacgtttctgttgattataagc犯actc犯ttgtgtattttg660ggatgtgctccagctattggagaacattgggctaaggg犯ctgcttgtaagtctagacca720ttgtctcaaggagattgtccaccattggaa"ttgaagaacactgttttggaagatggagat780atggttgatactggatatggagctatggatttctctactttgcaagatactaagtgtgaa840gttccattggatatttgtcaatctatttgtaagtatccagattatttgcaaatgtctgct900gatccatatggagattctatgttcttctgtttgagaagagaacaattgttcgctagacat960ttctggaacagagctggaactatgggagatactgttccacaatctttgtatattaaggga1020actggaatgagagcttctccaggatcttgtgtttattctccatctccatctggatctatt1080gttacttctgattctcaattgttcaacaagccatattggttgcataaggctcaaggacat1140犯caacggagtttgttggcataaccaattgttcgttactgttgttgatactactagatct1200actaacttgactatttgtgcttctactcaatctccagttccaggacaatatgatgctact1260aagttcaagcaatattctagacatgttgaag犯tatgatttgcaMtcattttccaattg1320tgtactatttactttgactgctgatgttatgtcttatattcattctatgaactcttctatt1380<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><210>8〈211〉59<212〉■<213>引物〈400>8tttgtggagaccttctgacaacactgtttacttgccacctccatccgttgctagagttg59〈210〉9〈211〉59〈212〉腿<213〉引物〈400〉9agcgtggt3gaaaatagaagttctagtaacgtagtcatcagtgttaacaactctagcaa59〈210〉10<211〉59〈212〉腿〈213〉引物〈400〉10ttctaccacgctggttcctctagattgttgactgttggtaacccttactttagagttcc59〈210〉11〈211〉59〈212>腿<213>引物〈400〉11ggtaagcggaaaccttaggaatatcttgcttgttaccaccaccagctggaactctaaag59〈210>12〈211〉59〈212〉DNA〈213〉引物'〈400〉12tttccgcttaccaatacagagttttcagagttcaattgccagaccctaacaagtttggt59〈210〉13〈211〉59〈212〉■〈213>引物<400〉13-caaaccaatctttgagtctcagggttgtaaatagaagtatctggcaaaccaaacttgtt5918〈210>14〈211〉59〈212〉腿〈213〉引物〈400〉14a聊ttggtttgggcttgtgctggtgttgaaattggt卿ggtcaaccattgggtgttg59〈210>15〈211〉59〈212〉DNA.〈213〉引物〈400〉15agactcagtatcgtccaacttgttgt卿aaggatgaccggacaaaccaacacccaatg59<210〉16〈211〉59<212〉DNA〈213>引物〈400〉16gatactgagtcttcccacgctgctacttctaacgtttccgaagacgttagagataacgt59〈210〉17〈211〉59(212>腿<213〉引物〈400>17gagcacaacccaaaatacacaattgagtttgcttgtagtcaacagaaacgttatctcta59〈210>18<211>59〈212〉腿<213〉引物〈400〉18tgggttgtgctccagctattggtgagcattgggctaagggtactgcttgtaagtccaga59〈210〉19<211>59<212>腿<213>引物<400〉19acagtgttcttc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