一种采用细胞融合技术生产异戊二烯的方法及其构建的融合子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用细胞融合技术生产异戊二烯的方法及其构建的融合子，主要利用原生质体融合技术，以大肠杆菌和真氧产碱杆菌为亲本，通过以油脂为唯一碳源和抗性标记质粒筛选，获得高效转化油脂的重组细胞，并利用该融合子发酵生产异戊二烯，该方法能够提高油脂代谢的速率、提高异戊二烯的产率，降低发酵成本。
【专利说明】一种采用细胞融合技术生产异戊二烯的方法及其构建的融合子
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵生产异戊二烯的方法，具体地说涉及一种采用细胞融合技术生产异戊二烯的方法。
技术背景
[0002]发酵法生产异戊二烯的原料一般采用葡萄糖、甘油等，相关报道异戊二烯产率的最高水平是11%，还不能达到工业生产的要求。以葡萄糖、甘油等原料，MVA途径的理论产率是25% ；以脂肪酸等油脂为原料，MVA途径的理论产率是68% (以C12为例)，远高于其他原料。综合考虑廉价的油脂原料来源广泛，产率高等特点，相对于葡萄糖等原料，将油脂转化生产异戊二烯更具有经济上优势，但是目前尚无相关报道。
[0003]以油脂为原料，利用微生物合成其他化学品已有报道。这些微生物主要包括热带假丝酵母Candida tropicalis,Candida bombicola,解脂耶氏酵母Yarrowia Iipolytica,真氧产喊杆菌Ralstonia eutropha H16,三抱布拉霉Blakeslea trispora,裙皱假丝酵母Candida rugosa,绿脓假单胞菌Pseudomonas Aeruginosa等。真氧产碱杆菌能够高效的利用植物油生产PHAs，油脂代谢率为2.0g/L/h左右，PHA含量为74%左右(Riedel 2012)，利用豆油合成PHA的油脂消耗速率为1.45g/L/h，产率在0.72~0.76g-PHA/g-soybean oil(Prihardi Kahar，2004)。以菜籽油为底物，利用解脂耶氏酵母发酵生产柠檬酸，菜籽油消耗速率为 0.7g/L/h,产率 150%( Svetlana V.Kamzolova, 2011)。Candida bombicola 能够转化菜籽油和葡萄糖，生产槐糖脂，产量达到365g/L (Young-Bum Kim, 2009)。添加豆油IOg/L,三孢布拉霉Blakeslea trispora发酵生产P _胡萝卜素产量提高40倍,使得干菌体中(6-胡萝卜素含量达到235mg/g DCffCFANI MANTZ0URID0U，2006)。然而上述菌株均为野生菌株，虽然油脂代谢速度快，但是遗传背景不清楚，难以进行改造为合成异戊二烯的生产菌株。·
[0004]目前没有利用油脂生产异戊二烯的相关报道。如何找到油脂代谢能力强，同时遗传背景清楚、基因操作简便的异戊二烯合成新菌株是生物法合成异戊二烯领域需要解决的关键问题之一。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有异戊二烯生产工艺中大肠杆菌油脂代谢能力差、异戊二烯产率低的问题，提供一种油脂代谢能力强的融合子。
[0006]该融合子于2013年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8030，分类命名为大肠杆菌和真养产碱杆菌的融合子，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0007]上述融合子CGMCC N0.8030是通过如下方法构建:
[0008]将工程大肠杆菌(携带异戊二烯合成途径的质粒)和带有庆大霉素抗性标记的真氧产碱杆菌分别接种在相应抗性的LB培养基中，培养至对数生长中后期，取菌液离心收集菌体，重悬于3~IOmL蔗糖高渗溶液I (SMMP)，用终浓度0.4~2g/L的溶菌酶35~40°C，处理8~16h。然后加入8-14mL的40%聚乙二醇溶液，混匀后30°C 2分钟进行原生质体融合，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL蔗糖高渗溶液II (SMM)溶液充分悬浮，然后涂布在含有5-34mg/L氯霉素、15-100mg/L青霉素和2.55_10mg/L庆大霉素的再生培养基(CMR)中，30°C培养1-2天。融合子经过摇瓶发酵，筛选异戊二烯产量最高的菌株。
[0009]本发明还提供了一种发酵生产异戊二烯的方法，是利用融合子CGMCC N0.8030发酵生产异戊二烯。
[0010]是融合子CGMCC N0.8030利用油脂为底物制备异戊二烯。
[0011]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
[0012]本发明提供的以油脂为底物合成异戊二烯的重组细胞和育种方法，包括利用原生质体融合技术，以产生异戊二烯的工程大肠杆菌和真氧产碱杆菌为亲本，通过以油脂为唯一碳源和抗性标记质粒筛选，获得重组细胞，融合子能够高效转化油脂生产异戊二烯。
[0013]所述的产生异戊二烯的工程大肠杆菌主要是来源于野生型细胞或商品化细胞，可以是 BL21 (DE3)、MG1655、JM109、JM109 (DE3)、DH5 a、K12、C41、C41 (DE3)和 XLl-blue。
[0014]所述的原生质体融合包括以下步骤:
[0015]将工程大肠杆菌(携带异戊二烯合成途径的质粒)和带有庆大霉素抗性标记的真氧产碱杆菌分别接种在相应抗性的LB培养基中，培养至对数生长中后期，取菌液离心收集菌体，重悬于3~IOmL蔗糖高渗溶液I (SMMP)，用终浓度0.4~2g/L的溶菌酶35~40°C，处理8~16h。然后加入8-14mL的40%聚乙二醇溶液，混匀后30°C 2分钟进行原生质体融合，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL蔗糖高渗溶液II (SMM)溶液充分悬浮，然后涂布在含有5-34mg/L氯霉素、15-100mg/L青霉素和2.55_10mg/L庆大霉素的再生培养基(CMR)中，30°C培养1-2天。融合子经过摇瓶发酵，筛选异戊二烯产量最高的菌株。
[0016]所使用的培养基SMMP为6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L 葡萄糖，14.7g/L K2HPO4, 5.4g/L KH2PO4,170g/L 蔗糖，2g/L 顺丁烯二酸，4g/LMgCl2 6H20, pH7.00
[0017]所使用的SMM 为 170g/L 蔗糖，2g/L 顺丁烯二酸，4g/L MgCl2 6H20, pH7.0。
[0018]所使用的CMR为(I )8g琼脂去离子水定容200mL ； (2)lmol/L琥珀酸钠溶液500mL，pH7.3 ；(3) 5%酪蛋白水解物IOOmL ；( 4) 10%酵母膏溶液50mL ；(5) 20%葡萄糖25mL ；(6)
.3.5% K2HPO4 和 1.5% KH2PO4 溶液 IOOmL ；(7) lmol/L MgCl2 溶液 20mL,混匀。
[0019]所使用的发酵培养基为MgS04 0.2~2g/L，KH2PO4 I~6g/L,甜菜碱0.2~2g/L,硫酸铵I~5g/L,牛肉浸粉I~10g/L,柠檬酸0.5~2g/L，柠檬酸三钠0.5~2g/L，KCl.0.5 ~2g/L，FeS04 ? 7H20 20 ~100mg/L。吐温 60 0.5 ~5g/L，DMSO 0.5 ~5g/L。
[0020]1000 倍微量元素储液((NH4)6Mo7O24 ? 4H20 0.37g; ZnSO4 ? 7H20 0.29g; H3BO4
.2.47g; CuSO4 ? 5H20 0.25g;MnCl2 ? 4H20 1.58g 用蒸馏水定容至 IOOmL 过滤除菌)。
[0021]优选，在发酵培养基中按照0.1%比例加入1000倍微量元素储液。
[0022]本发明提供的以油脂为底物合成异戊二烯的重组细胞及其育种方法，是基于这样的思路:首先，大肠杆菌遗传背景清楚，基因操作方便，生长速度快，能够以葡萄糖为碳源，在无机盐培养基中实现高密度发酵，是生成异戊二烯的常用宿主。但是，在利用油脂生产异戊二烯的发酵工艺中，大肠杆菌油脂代谢速率低的问题是整个异戊二烯生产工艺的瓶颈。其次，真氧产碱杆菌的具有极强的油脂代谢能力，基因组包含2个脂肪酸3氧化途径和脂肪酶。第三，原生质体融合技术能够有效地结合大肠杆菌和真氧产碱杆菌两个亲本的优势，筛选出高效代谢油脂的融合子，同时具有异戊二烯的生产能力。第四，大肠杆菌和真氧产碱杆菌都属于革兰氏阴性菌，具有较好的同源性，有利于原生质体的融合和基因重组。
[0023]本发明具有以下创新点和有益效果:
[0024]1、新的重组细胞油脂代谢能力强，同时基因操作简便。
[0025]2、新的重组细胞能够生产异戊二烯 。
【专利附图】
【附图说明】:
[0026]图1菌株Y3型态
[0027]图2菌株Y5型态
[0028]图3菌株Y6型态
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]带有庆大霉素抗性标记的真氧产碱杆菌接种在LB培养基中，培养至对数生长中后期，取菌液离心收集菌体，重悬于3mL蔗糖高渗溶液I (SMMP)，用终浓度0.4g/L的溶菌酶35°C，处理8h。制备真氧产碱杆菌的原生质体。
[0031 ] 所使用的培养基SMMP为6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L 葡萄糖，14.7g/L K2HPO4, 5.4g/L KH2PO4,170g/L 蔗糖，2g/L 顺丁烯二酸，4g/LMgCl2 6H20, pH7.00
[0032]所使用的SMM 为 170g/L 蔗糖，2g/L 顺丁烯二酸，4g/L MgCl2 6H20, pH7.0。
[0033]实施例2
[0034]将工程大肠杆菌(携带异戍二烯合成途径的质粒,可参见yang, plosone, 2012)接种在LB培养基中，培养至对数生长中后期，取菌液离心收集菌体，重悬于IOmL蔗糖高渗溶液I (SMMP)，用终浓度2g/L的溶菌酶40°C，处理16h。制备大肠杆菌原生质体。
[0035]然后与实施例1中获得的真氧产碱杆菌的原生质体的融合和再生。加入14mL的40%聚乙二醇溶液，混匀后30°C 2分钟进行原生质体融合，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL蔗糖高渗溶液II (SMM)溶液充分悬浮，然后涂布在含有34mg/L氯霉素、100mg/L青霉素和10mg/L庆大霉素的再生培养基(CMR)中，30°C培养1_2天。共获得18株融合子，以月桂酸和花生油为碳源，经摇瓶筛选，其中融合子Y3、Y5、Y6异戊二烯产量分别为SOmg/L、1.2mg/L 和 L 9mg/L。
[0036]该融合子Y3于2013年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8030，分类命名为大肠杆菌和真养产碱杆菌的融合子，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0037]所使用的培养基SMMP为6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L 葡萄糖，14.7g/L K2HPO4, 5.4g/L KH2PO4,170g/L 蔗糖，2g/L 顺丁烯二酸，4g/LMgCl2 6H20, pH7.00[0038]所使用的SMM 为 170g/L 蔗糖，2g/L 顺丁烯二酸，4g/L MgCl2 6H20, pH7.0。
[0039]所使用的CMR为(I )8g琼脂去离子水定容200mL ； (2)lmol/L琥珀酸钠溶液500mL，ρΗ7.3 ；(3) 5%酪蛋白水解物IOOmL ；( 4) 10%酵母膏溶液50mL ；(5) 20%葡萄糖25mL ；(6)
3.5%K2HP04 和 1.5%KH2P04 溶液 IOOmL ；(7) lmol/L MgCl2 溶液 20mL，混匀。
[0040]所使用的发酵培养基为月桂酸5g/L，花生油5g/L，MgS04 0.2~2g/L，KH2PO4 I~6g/L,舌甘菜碱0.2~2g/L,硫酸铵I~5g/L,牛肉浸粉I~10g/L，梓檬酸0.5~2g/L,梓檬酸三钠 0.5 ~2g/L，KCl 0.5 ~2g/L，FeS04.7Η20 20 ~100mg/L,吐温 60 0.5 ~5g/L,DMSO 0.5 ~5g/L。
[0041]1000 倍微量元素储液((NH4)6Mo7O24.4H20 0.37g; ZnSO4.7H20 0.29g; H3BO4
2.47g; CuSO4.5H20 0.25g;Mn Cl2.4H20 1.58g 用蒸馏水定容至 IOOmL 过滤除菌)。
【权利要求】
1.一种利用油脂生产异戊二烯的融合子，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8030，分类命名为大肠杆菌和真养产碱杆菌的融合子。
2.一种采用细胞融合技术生产异戊二烯的方法，是利用融合子CGMCC N0.8030发酵生产异戊二烯。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，CGMCCN0.8030是以油脂为底物发酵生产异戊二烯。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，发酵培养基为月桂酸5g/L，花生油5g/L，MgSO4 0.2~2g/L，KH2PO4 I~6g/L,甜菜碱0.2~2g/L，硫酸铵I~5g/L,牛肉浸粉I~10g/L，柠檬酸 0.5 ~2g/L，柠檬酸三钠 0.5 ~2g/L，KCl 0.5 ~2g/L，FeSO4 ? 7H20 20 ~100mg/L,吐温 60 0.5 ~5g/L, DMSO 0.5 ~5g/L。
5.权利要求1所述融合子的构建方法，是将携带异戊二烯合成途径的质粒的大肠杆菌和带有庆大霉素抗性标记的真氧产碱杆菌分别接种在相应抗性的LB培养基中，培养至对数生长中后期，取菌液离心收集菌体，重悬于蔗糖高渗溶液I，用溶菌酶处理，然后加入聚乙二醇溶液，混匀后进行原生质体融合，离心弃上清液，用蔗糖高渗溶液II溶液充分悬浮，然后涂布在含有氯霉素、青霉素和庆大霉素的再生培养基中，培养1-2天，筛选融合子。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，将携带异戊二烯合成途径的质粒的大肠杆菌和带有庆大霉素抗性标记的真氧产碱杆菌分别接种在相应抗性的LB培养基中，培养至对数生长中后期，取菌液离心收集菌体， 重悬于3~IOmL蔗糖高渗溶液I，用终浓度0.4~2g/L的溶菌酶35~40°C，处理8~16h，然后加入8_14mL的40%聚乙二醇溶液，混匀后300C 2分钟进行原生质体融合，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL蔗糖高渗溶液II溶液充分悬浮，然后涂布在含有5-34mg/L氯霉素、15-100mg/L青霉素和2.55-10mg/L庆大霉素的再生培养基中，30°C培养1-2天，筛选融合子。
【文档编号】C12R1/19GK103571820SQ201310474165
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】咸漠, 刘辉, 张海波, 邹慧斌 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所