赋予玉米斐济病毒抗性的主要qtls的制作方法
【专利摘要】本发明涉及赋予玉米斐济病毒抗性的主要QTLS。本发明涉及用于鉴定具有对斐济病毒，尤其是Mal?de?Río?Cuarto病毒(MRCV)和/或玉米粗缩病毒(MRDV)的新赋予的抗性或该抗性增强，或易感该病毒的玉米植物的组合物和方法。该方法使用分子遗传标记鉴定、选择和/或构建抗性植物或鉴定和反选择易感植物。由本发明方法产生的表现出新赋予的斐济病毒抗性或该抗性增强的玉米植物，也是本发明的一方面。
【专利说明】赋予玉米斐济病毒抗性的主要QTLS
[0001]本申请为申请号为200880114461.4的分案申请，要求2007年11月I日的优先权。
[0002]引用的相关申请
[0003]本申请要求2007年11月I日提交的美国临时申请61/001，455号的优先权，将其通过引用整体并入。
发明领域
[0004]本申请涉及用于在植物中产生或增强斐济病毒，尤其是Mal de R1 Cuarto病毒和/或玉米粗缩病毒抗性的组合物和方法。此外，本发明涉及由本发明组合物遗传转化的植物。
[0005]发明背景
[0006]在阿根廷，由Malde R1 Cuarto病毒(MRCV)造成的疾病是主要的玉米疾病，在大爆发的年份中占到产量损失的70%以上(Rodriguez PE et al.(1998)Plant Dis.82:149-52)。该疾病是斐济病毒(Fijivirus)血清群2的成员，该血清群2包括其他病毒例如玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus),水稻黑条矮缩病毒(rice black streakeddwarf virus),和马唐矮化病毒(pangola stunt virus) (Uyeda I & Milne RG(1995)Semin.Virol.6:85-88)。MRCV 的主要载体是 Delphacodes kuscheli,但其他 Delphacodes种类，例如D.haywardi和D.tigrinus,以及Toya propinqua,已证实可携带该病毒。该病毒未显不出经种子传播至子代。Dist6fano et al.,Arch.Virol.147:1699-1709 (2002),分析了 MRCV序列，并提出其是一种新的与MRDV(玉米粗缩病毒)相关的斐济病毒种类。在多个欧洲国家(例如，捷克、法国、·意大利、挪威、西班牙、瑞典)和中国都发现了 MRDV，同时在乌拉圭也检测到 MRCV (Ornaghi J.A., Beviacqua J.E.,Aguirrezabala D.A.,March G.J.andLenardon S.L1999.Detection of Malde R1 Cuarto virus in Uruguay.FitopatologiaBrasileira 24:471)。
[0007]MRCV感染引起玉米发育异常并明显降低作物产量。易感表型包括生长迟缓，节间缩短，具有散落颗粒的多穗，无花药的畸形雄花穗，叶片背面存在小的突起，退化根，切断和退化叶片。植物症状取决于植物的物候期、植物基因型和环境(Lenard6n et al.，“Virus del Mal de R1 Cuarto en maiz”，in Proyecto de Investigaciones enFitovirologia(Lenardon ed.), 2:10(1999)。若在胚芽鞘即第一叶阶段感染,会出现非常严重的症状。
[0008]在1996-1997年严重的MRCV爆发中，在阿根廷有超过300，000公顷玉米受到感染，造成的损失总计约$120，000, 000美元。在2006年，Delphacodes kuscheli数量的增加明显，导致阿根廷玉米植物重新出现病毒疾病，这显著地影响到2007年收成。在易感地区(科尔多瓦省)，易感基因型受到MRCV的强烈感染，而在其他玉米地区，则受到适度感染。
[0009]分子遗传标记的开发，已促进玉米中重要农业性状的定位和选择。与抗病性基因紧密连锁的标记,是通过使用标记辅助选择(marker assisted selection,MRS)、根据基因型快速鉴定抗性玉米系的宝贵资源。也可通过使用适宜的DNA标记，促进抗病性基因向所需培育植物的基因渗入。
[0010]分子标记和标记辅助诜择
[0011]遗传图谱(genetic map)是基因组(或基因组的一部分例如单个染色体)的图解表示，其中通过界标之间的重组频率测量染色体界标之间的距离。遗传界标可以是多种已知多态性标记的任何标记，例如但不限于分子标记例如SSR标记，RFLP标记，FLP标记,或SNP标记。而且，SSR标记可以是来自于基因组或表达的核酸(例如ESTs)的。这些物理界标的特性和用于检测它们的方法不同，但基于多核苷酸长度和/或序列，所有这些标记在物理上是相互可区别的(以及在任一具体标记的多个等位基因之间)。 [0012]尽管编码蛋白的具体DNA序列在物种之间通常是非常保守的，但DNA的其他区域(通常是非编码区)会累积多态性，因此在同一物种的个体之间是可变的。这些区域为大量分子遗传标记提供了基础。通常，在子代之间分离的任何不同遗传多态性状(包括核酸多态性)都是潜在的标记。基因组可变性可以是任何起源的，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件，或转座元件的存在和序列。在本领域中已知大量的玉米分子标记，且是公开的或可从不同来源获得的，例如MaizeGDB互联网资源。同样，许多检测分子标记的方法也完全建立。
[0013]从植物育种者角度来看，发展分子标记技术的主要动机在于，通过标记辅助选择(MAS)提高育种效能。与所需表型性状(例如数量性状位点(quantitative trait locus),或QTL，例如具体抗病性)表现出连锁不平衡的分子标记等位基因，为在植物种群中选择所需性状提供了可用工具。实行这种方法的关键步骤是:(i)形成分子标记的密集遗传图谱，(ii)根据标记和表型可变性之间的统计关联检测QTL，(iii)根据QTL分析结果，确定一组所需的标记等位基因，和(iv)使用和/或外推这些信息至现有的育种种质(breedinggermplasm)中，以使基于标记的选择决定得以进行。
[0014]含有增加密度的公共玉米标记的玉米基因组的完整的连锁图的有效性，有助于玉米遗传作图(genetic mapping)和MAS。参见例如万维网上的Maize⑶B资源。
[0015]两类标记被频繁用于标记辅助选择方案，即简单重复序列(simple sequencerepeat, SSR，也称为微卫星)标记和单核苷多态性(SNP)标记。术语SSR通常指任何类型的导致长度可变性的分子异质性，且最常是含有两个或三个碱基对序列的多倍串联重复的DNA短片段(高达几百个碱基对)。因为复制保真度差，例如由聚合酶滑动引起，这些重复序列会导致长度可变的高度多态DNA区域。SSRs看起来随机分布在整个基因组中，且其侧翼通常为保守区。SSR标记也可来源于RNA序列(采用cDNA、部分cDNA或EST形式)以及基因组物质。
[0016]SSR异质性的特征使它们非常适合用作分子遗传标记，即SSR基因组可变性是遗传的、多等位基因的、共显性的并且是重现可检测的。日益尖端的基于扩增的检测技术(例如，基于PCR)的增加，为核苷酸序列异质性检测提供了多种灵敏方法。将设计引物(或其他类型的探针)设计为与位于SSR区侧翼的保守区杂交，从而使可变的SSR区扩增。由SSR区产生的不同大小的扩增子具有特征性和可复制的大小。由同一个体或来自植物种群不同个体的两条同源染色体获得的不同大小的SSR扩增子，通常被称为“标记等位基因”。只要存在至少两个可产生带有至少两个不同大小的PCR产物的SSR等位基因，则该SSRs可以用来作为标记。[0017]依赖单核苷酸多态性(SNPs)的玉米标记也是本领域公知的。已发展多种技术用于检测SNPs，包括等位基因特异性杂交(ASH;参见例如Shattuck-Eidens et al.，(1991) “Rapid detection of maize DNA sequence variation，，，Genet.Anal.Tech.Appl.8:240-245)。也广泛使用其他类型的分子标记，包括但不限于表达的序列标签(ESTs)和来源于EST序列的SSR标记，限制性片段长度多态性(RFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)，随机扩增DNA多态性(RAPD)和同工酶标记。广泛地用于检测这种多变性的方案也是本领域技术人员已知的，且这些方案通常是特异性针对它们设计检测的多态性类型。例如，PCR扩增、单链构型多态性(SSCP)和自主序列复制(self-sustainedsequence replication, 3SR ;参见Chan and Fox,“NASBA and other transcription-basedamplification methods for research and diagnostic microbiology，，，Reviews inMedical Microbiology 10:185-196(1999))。
[0018]也可产生多种类型的FLP标记。最常见的是，使用扩增引物产生片段长度多态性。这种FLP标记在许多方面都类似于SSR标记，除了引物所扩增的区域通常不是高重复区之外。扩增的区域或扩增子在种质之间仍旧会具有足够的可变性，通常是由于插入或缺失引起的，使得由扩增引物产生的片段可在多态个体中区别出来，已知在玉米中经常发生这种插入缺失(indels) (Bhattramakki et al.(2002)Plant Mol Biol 48,539-547 ；Rafalski (2002) Plant Sci 162:329-333)。术语“插入缺失”是指插入或缺失，其中一条链相对于第二条链称为具有插入，或第二条链相对于第一条链称为具有缺失。本文公开的MZA标记是已经过选择的扩增的FLP标记的实例，因为它们非常接近主要染色体2的QTL。
[0019]一个分子标记与另一分子标记的连锁作为重组频率来测量。通常，两个位点(例如两个SSR标记)在遗传图谱上越近，它们在物理图谱上也相互越近。相对遗传距离(由交换频率测定，以厘摩衡量；cM)与在染色体上两个连锁位点彼此相隔的物理距离(由碱基对衡量，例如千碱基对(kb)或兆碱基对(Mbp))通常是成比例的。CM和物理距离之间的精确比例的缺乏，可由在不同染色体区重组频率的变化获得，例如某些染色体区是重组“热点(hot spot)”，而其他区域未表现出任何重组，或只发生了很少的重组事件。通常，一个标记与另一标记越接近，无论是根据·重组或物理距离测量，它们都连锁得越坚固。在某些方面，一个分子标记与编码赋予具体表型(抗病性)的多肽的基因越接近，无论根据重组或物理距离测量，该标记都更好地标记所需表型性状。
[0020]遗传作图可变性也可在同一作物物种包括玉米的不同种群之间观察到。尽管这种遗传作图的可变性会出现在种群之间，但是来源于一个种群的遗传图谱和标记信息通常仍然可用于在多个种群间鉴定具有所需性状的植物，反选择具有不需要性状的植物和指导MAS0
[0021]QTL 作图
[0022]植物育种者的目标是为具有所需性状例如病原体抗性的个体选择植物和富集植物种群，从而最终提高农业生产率。很长时间以来已经认识到，可将与具体表型数量相关的具体染色体位点(或区间)绘制在生物体基因组中。这种位点被称为数量性状位点或QTL。植物育种者可有利地利用分子标记通过鉴定标记等位基因来鉴定所需个体，该等位基因显示出在统计上明显可能与所需表型(例如病原体抗性)共分离，从而证明为连锁不平衡。通过鉴定与数量性状共分离的分子标记或分子标记簇，育种者可鉴定一个QTL。通过鉴定和选择与所需表型相关的标记等位基因(或所需的来自多个标记的等位基因)，植物育种者能够通过选择适当的分子标记等位基因来快速选择所需表型(称为标记辅助选择过程或MAS)。位于遗传图谱上的分子标记越多，图谱适宜进行MAS的潜在有效性就越大。
[0023]已发展多个实验范例来鉴定和分析QTL (参见例如Jansen (1996) TrendsPlant Sci 1:89)。关于作物物种QTL作图的大部分公开报道是基于使用双亲代杂交(b1-parental cross， Lynch and Walsh(1997)Genetics and Analysis of QuantitativeTraits, Sinauer Associates，Sunderland)。通常，这些范例包括使一个或多个亲代对杂交，它们可以是例如来自两个近交品系的单配对，或不同近交品系或系的多个相关或无关亲代，它们都表现出与感兴趣表型性状相关的不同特征。通常，这些实验范例包括由两个歧化近交系的单交(例如经选择系之间使表型和分子标记差异最大)获得100-300个分离的子代。在亲代和分离子代中对多个标记位点进行基因分型并对一个至多个数量性状(例如抗病性)进行评估。而QTL鉴定为在分离子代中基因型值和表型可变性之间的明显统计关联。这些实验方案的强度来自于近交后代杂交(inbred cross)的利用，因为获得的Fl亲代都具有相同的连锁相。因此，Fl亲代自交后，所有分离子代(F2)是有信息的且连锁不平衡达到最大，连锁相是已知的，只有两个QTL等位基因，而且除回交子代之外，每个QTL等位基因的频率是0.5。
[0024]用于测定标记是否与QTL(或与另一标记)遗传连锁的许多统计方法是本领域技术人员已知的，包括例如标准线性模型，例如ANOVA或回归作图(Haley andKnott (1992) Heredity69:315)，最大可能性方法例如期望_最大化算法(如Lander andBotstein(1989) “Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits usingRFLP linkage maps”，Genetics 121:185-199 ;Jansen(1992) “A general mixture modelfor mapping quantitative trait loci by using molecular markers”，Theor.Appl.Genet.，85:252-260 ;Jansen(1993) “Maximum likelihood in a generalized linearfinite mixture model by using the EM algorithm”，Biometrics 49:227-231 ；Jansen(1994)‘‘Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers:an overviewof biometrical models”，In J.W van Ooijen and J.Jansen(eds.),Biometrics in Plantbreeding-applications of molecular markers，pp.116—124，CPR0-DL0 Metherlands ；Jansen(1996) “A general Monte Carlo method for mapping multiple quantitativetrait loci，，，Genetics 142:305-311 ；and Jansen and Stam(1994) “High Resolutionof quantitative trait into multiple loci via interval mapping，，，Genetics 136:1447-1455)。示例性统计方法包括单点标记分析、区间作图(interval mapping, Landerand Botstein (1989) Genetics 121:185)、复合区间作图(complex interval mapping)、惩罚回归分析(penalized regression analysis)、复合系谱分析(complex pedigreeanalysis)、MCMC 分析、MQM 分析(Jansen (1994)Genetics 138:871)、HAPLO-1M+ 分析、HAPL0-MQM 分析、HAPL0-MQM+分析、贝叶斯 MCMC、岭回归(ridge regression)、血统同一性分析(identity-by-descent analysis)、Haseman_Elston 回归，以上任何都适用于本发明。此外，在美国专利N0.6，399，855和WO 0149104中描述了有关可用于鉴定和定位QTLs的适用于复合育种种群(complex breeding populations)的可选统计方法的其他细节。这些方法中的任何方法都是高度运算的，通常在计算机系统和专门软件的辅助下进行。适宜的统计软件包可从多个公共和商业来源获得，这是本领域技术人员已知的。
[0025]Sala等在阿根廷专利申请ARP20030100125号中公开了与玉米植物MRCV抗性相关的三个 QTL 等位基因的组合。该位点与 bnlgl017，bnlg2277，bnlgl25，bnlg38UPbnlgl80的偏好抗性标记等位基因相连，其中存在所有赋予抗性的等位基因时，出现抗性。
[0026]在本领域中需要可抵抗斐济病毒尤其是MRCV和MRDV和它们的致病剂例如Delphacodes kuscheli感染的改良玉米品系。在本领域中需要鉴定表现出斐济病毒抗性的玉米植物或种群(种质)的方法。本领域需要鉴定与斐济病毒抗性位点连锁的分子遗传标记，促进MAS，并也需要赋予斐济病毒抗性的基因等位基因的基因发现和克隆。这些标记可用于在玉米种群中选择显示出偏好标记等位基因的个体植物和植物种群，然后用其选择抗性表型，或可选地用于反选择显示出斐济病毒易感性表型的植物或植物种群。本发明提供了这些和其他优势。
[0027]发明概述
[0028]提供了用于鉴定具有新赋予的或增强的斐济病毒抗性的玉米植物或种质的组合物和方法。还提供了产生抵抗斐济病毒的玉米植物或种质的方法，例如通过所需抗性标记等位基因的基因渗入和/或通过转基因产生方法，以及通过这些方法产生的植物和种植。选择抗性植物和种质的系统和试剂盒，也是本发明的一部分。
[0029]在一些方面，本发明提供了鉴定具有对MRCV的新赋予的抗性、抗性增强或易感性的第一玉米植物或种质(例如系或品种)。在这些方法中，在第一玉米植物或种质中，检测至少一个或多个与新赋予的抗性、抗性增强或易感性相关的标记位点(例如，多个标记位点)的至少一个等位基因。 可从表1和2所提供的位点，包括MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105，以及任何与这些QTL标记连锁的其他标记(例如这些位点约IOcM之内的)中选择标记位点。表1和2显示了通过结合作图分析和QTL区间作图(包括单标记回归分析)方法确定的证实与MRCV抗性表型连锁不平衡的玉米标记。该表表明，基因组-SSR或EST-SSR标记型(所有简单重复序列)，或SNP或MZA标记，定位有标记的染色体及其相对于其他已知标记的大概遗传图谱位置，以CM表示，在染色体上的零位置是第一(最末端)标记。还显示了用于标记随机分离分析和统计概率的玉米种群，和考虑了多检验的可变性和假阳性作为调整概率(adjusted probability)给出的抗性/易感性表型。还显示了单标记回归的概率值。
[0030]本发明也提供了与MRCV相关的染色体QTL区间。这些区间位于连锁组2上。发现位于这些区间之内的任何标记也可作为MRCV抗性标记，这也是本发明的一部分。这些区间包括:
[0031](i)MZA8381 和 MZA18180 ；
[0032](ii)MZA4305 和 MZA2803 ；
[0033](iii)MZA15490 和 MZA2038 ；
[0034](iv)bnlgl458b 和 umcl261a ；
[0035](v)bnlgl458b 和 umcl262a ；
[0036](vi) bnlgl327 和 umcl261a ;以及
[0037](viii)bnlgl327 和 umcl262a。
[0038]在同一植物中可选择多个标记位点。组合选择哪些QTL标记是没有特别限制的。组合使用的QTL标记可以使表1和2所列的任何标记，与表1和2中的标记连锁的任何其他标记（例如由MAZEGDB资源确定的连锁标记），或本文所述QTL区间内的任何标记。
【权利要求】
1.鉴定表现出对里奥夸尔托病毒(Mai de R1 Cuarto Virus,MRCV)或玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus, MRDV)的新赋予的抗性或抗性增强的第一玉米植物或种质的方法，该方法包括，在所述第一玉米植物或种质中检测侧翼为MZA8381和MZA18180并包括MZA8381和MZA18180的染色体区间内的单元型，其中: a.对于MZA8381的共有序列是SEQID NO:2和对于MZA18180的共有序列是SEQ IDNO:36 ； b.所述单元型包含: 1.在MZA16656-19-A的“G”，其中所述“G”位于SEQID NO:20的位置218 ;在MZA15490-801-A 的 “G”，其中所述 “G” 位于 SEQ ID NO:22 的位置 96 ;在 MZA15490-137-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO:24的位置84 ;在MZA2038-71-A的“A”，其中所述“A”位于 SEQ ID NO:17 的位置 258 ;在 MZA2038-76-A 的 “T”，其中所述 “T” 位于 SEQ ID NO:16的位置277 ;在MZA11826-801-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO:26的位置89 ;在MZA11826-803-A 的“C”，其中所述“C”位于 SEQ ID NO:27 的位置 701，以及在 MZA9105-8-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO:12的位置123 ;或 i1.在 MZA16656-19-A 的 “A”，其中所述“A” 位于 SEQ ID NO:20 的位置 218 ;在MZA15490-801-A 的 “C”，其中所述 “C” 位于 SEQ ID NO:22 的位置 96 ;在 MZA15490-137-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO:24的位置84 ;在MZA2038-71-A的“T”，其中所述“T”位于 SEQ ID NO:17 的位置 258 ;在 MZA2038-76-A 的 “C”，其中所述 “C” 位于 SEQ ID NO:16的位置277 ;在MZA11826-801-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ ID NO:26的位置89 ;在MZA11826-803-A 的“T”，其中所述“T”位于 SEQ ID NO:27 的位置 701，以及在 MZA9105-8-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO:12的位置123 ;以及 c.如果检测到所述单元型，选择所述第一玉米植物或种质作为表现出对里奥夸尔托病毒(MRCV)或玉米粗缩病毒(MRDV)具有新赋予的抗性或抗性增强。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述第一玉米植物或种质中的单元型渗入至第二玉米植物或种质，以产生基因渗入的玉米植物或种质。
【文档编号】C12Q1/70GK103589805SQ201310485429
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2008年10月31日 优先权日:2007年11月1日
【发明者】特瑞希塔.马丁, 何塞.阿勒詹德罗.弗朗奇诺, 恩瑞克.多明戈.克里夫, 安娜.玛丽亚.布鲁科皮乌克, 艾德里安纳.托马斯, 斯坦利.D.卢克, 国平.G.舒 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司