对虾白斑综合症病毒（wssv）的lamp检测引物组及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种WSSV对虾白斑综合症病毒（WSSV）LAMP检测引物组、检测试剂盒。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照品；试剂盒还包含显色剂。本发明的试剂盒操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到1fg/μL；准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。
【专利说明】对虾白斑综合症病毒(WSSV)的LAMP检测引物组及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾白斑综合症病毒(WSSV)的LAMP检测引物组及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是1993年世界范围内对虾暴发性流行病的主要病原，迄今仍然没有能有效控制WSSV疫情的技术措施。国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的WSSV病原检测方法是减少白斑综合征发生和危害的重要途径。目前WSSV病原的检测方法主要有目视观察法、组织学方法、电子显微技术、生化检验法、免疫学方法和分子生物学方法等。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展，但这种方法耗时、特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。自问世以来，PCR技术凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验环境和操作要求苛刻，产物容易污染，导致假阳性。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测 中的应用还不多。建立检测WSSV快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。
[0003]环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是NOTOMI 等建立的一种新的核酸扩增技术，在6(T65 °C的恒温条件下，历时3(T60 min，即可完成核酸扩增反应。LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。
[0004]德国QIAGEN公司研发的恒温反应及检测仪器ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来实时判断反应的进行。比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠。由于过程的数据化和自动化，可用于科研，开发新的检测方法。由于其便携、易操作，比起定量PCR仪，节约了大量成本，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。
[0005]由于ESE-Quant tube scanner通过吸收突光来判断反应是否进行,前期研究发现，常用的突光显色剂SYBR Green I过于灵敏,在ESE-Quant tube scanner上常造成阴性反应孔出现非特异性的扩增曲线，影响结果判断。尤其在样品不纯的情况下。此反应对模板纯度要求较高，如果样品杂质含量较多，ESE-Quant tube scanner上的扩增曲线将呈现不集中，倾斜向上等。SYT0-9作为SYBR Green I的下一代产品荧光显色剂可以避免上述缺陷。
[0006]对于WSSV病毒DNA的提取可采用研磨法提取上清中的病毒核酸，而不采用蛋白酶消化组织的方法。样品为成年虾的，主要采集消化腺、前足等，虾苗则直接研磨。对于虾仁的检测，先用匀浆机对数个虾仁进行匀浆，再取少量虾肉进行研磨提取。这样节省了蛋白酶作用的时间，更重要的是消除了大量杂质及色素，减少了对后续LAMP反应的抑制。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测引物组。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒。 [0009]本发明的另一个目的在于提供对虾白斑综合症病毒的LAMP检测方法。
[0010]本发明所采用的技术方案如下:
一种对虾白斑综合症病毒(WSSV)的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
WSSV-F3:ACAACACTGTGACCAAGAC (SEQ ID N0:1)；
WSSV-B3:GTTCCACACCTTGAATGTTC (SEQ ID NO:2);
WSSV-FIP:CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG (SEQ ID NO:3);
WSSV-BIP:CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG (SEQ ID N0:4)；
WSSV-LF:CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA (SEQ ID NO:5);
WSSV-LB:ATGAAGGAAGAAGATGCGGAT (SEQ ID NO:6)。
[0011]一种对虾白斑综合症病毒(WSSV)的LAMP检测试剂盒，包括上述3对检测引物组。
[0012]上述检测试剂盒，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
[0013]上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为1: 8: 4。
[0014]上述检测试剂盒,所述DNA聚合酶为DNA聚合酶。
[0015]上述检测试剂盒，所述LAMP反应液由IOmM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液三者按体积比8: 5: 2组成。
[0016]上述检测试剂盒，所述阳性对照为含有对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白基因片段的T载体，阴性对照为超纯水。
[0017]上述检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYT0-9。
[0018]上述的试剂盒检测对虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
2)恒温基因扩增反应:25μI反应体系含有:WSSV-F3 0.2 μ M, WSSV-B3 0.2 μ Μ,WSSV-FIP 1.6 μ Μ, WSSV-BIP 1.6 μ Μ, WSSV-LF 0.8 μ Μ, WSSV-LB 0.8 μ Μ, LAMP 反应液12.5 μ 1，DNA聚合酶10U，待检DNA I~lOOng，用超纯水补齐到25 μ I ;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63°C反应30~60min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果。浊度仪软件界面出现“ S ”形扩增曲线为阳性，否则为阴性。
[0019]在上述试剂盒中含有显色剂的情况下，其LAMP检测方法包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
2)恒温基因扩增反应:25μI反应体系含有:WSSV-F3 0.2 μ M, WSSV-B3 0.2 μ Μ,WSSV-FIP 1.6 μ Μ, WSSV-BIP 1.6 μ Μ, WSSV-LF 0.8 μ Μ, WSSV-LB 0.8 μ Μ, LAMP 反应液12.5μ L, DNA 聚合酶 10U，待检 DNA I~lOOng，10XSYT0-9 0.5 μ L，用超纯水补齐到 25 μ I ；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63°C反应30~60min,并在 80°C持续 2min ；
3)将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。
[0020]本发明的有益效果是:
O快速高效:整个扩增只用30~60min即可完成，扩增产量可达IO9~101°个拷贝；
2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
3)高特异性:本发明对病毒IHHNV (infectious hypodermal and hematopoieticnecrosis virus)、自Ij 溶血弧菌(K/fo-1o Parahemolyticus)> 仓丨J 伤弧菌(K/fo-1ovulnificus )、01 群霍乱弧菌(Kibrio cholera 01)、0139 群霍乱弧菌(K/brio cholera0139)的DNA均不发生扩增。
[0021]本发明设计的六条特异性引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
4)高灵敏度:本发明的最低检测极限可达到2fg/反应；
5)鉴定简便:本发明可通过是否存在焦磷酸镁沉淀，或者加入SYT0-9，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为LAMP检测方法对WSSV病毒的特异性实验图；
图2为LAMP检测方法对WSSV病毒的灵敏度实验图，从左到右的曲线依次为10pg/>L、lpg/^L、100fg/^L、10fg/^L、lfg/^L、100ag/>L、10ag/>L、lag/μ? 的阳性标准品的扩增结果;
图3为不同检测方法对WSSV病毒检测灵敏度的比较，A为本发明的LAMP检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，B为现有Real-time PCR检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，C为现有巢式PCR检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，D、E、F、G分别为现有不同的LAMP检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度。
【具体实施方式】
[0023]以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0024]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0025]实施例1:
一、对虾白斑综合症病毒LAMP检测试剂盒的建立
对虾白斑综合症病毒 的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、fciDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。
[0026]I) LAMP引物设计:根据从Genbank上检索到的对虾白斑综合症病毒(WSSV)的核酸序列，选取保守序列，设计用于检测WSSV的特异性引物，其序列见下表1:
表1引物序列表
【权利要求】
1.一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
WSSV-F3:ACAACACTGTGACCAAGAC ；
WSSV-B3:GTTCCACACCTTGAATGTTC ；
WSSV-FIP:CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG ；
WSSV-BIP:CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG ；
WSSV-LF:CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA ；
WSSV-LB:ATGAAGGAAGAAGATGCGGAT。
2.—种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于:检测试剂盒包括权利要求I所述的检测引物组 。
3.根据权利要求2所述的对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于:还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
【文档编号】C12R1/93GK103540687SQ201310485400
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】李红梅, 赵哲, 刘助红, 唐大运, 叶蕾, 张璜, 石磊 申请人:广州迪澳生物科技有限公司