广州管圆线虫病早期检测的分子标记物及引物的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物学领域，涉及一种可作为早期广州管圆线虫病早期检测的分子标志物，以及所用引物及相关试剂盒。该诊断试剂的必要组成包含：aca-miR-146a-5p序列及根据该序列设计的相应的三条引物（茎环引物，上下游引物）。本发明是首次提出将aca-miR-146a-5p应用于制备抗广州管圆线虫病的诊断。该诊断试剂具有早期、准确、简易的检测出广州管圆线虫感染，能把广州管圆线虫感染引起的脑膜炎或者脑炎和其他脑膜炎或者脑炎鉴别的优点，具有很好的社会和经济效益。
【专利说明】广州管圆线虫病早期检测的分子标记物及引物
【技术领域】
[0001]本专利属于生物学领域，涉及一种可作为早期广州管圆线虫病早期检测的分子标志物，以及所用引物及相关试剂盒。
【背景技术】
[0002]广州管圆线虫病又称嗜酸粒细胞增多性脑膜脑炎。是因吃了生的或不熟的含有广州管圆线虫幼虫的淡水螺肉而感染，幼虫寄生在中枢神经系统而致病。主要临床表现为脑膜炎、脊髓膜炎、脑炎或脊髓炎，末梢血和脑脊液内嗜酸性粒细胞数量增高，重型者可有持续性高颅压；有脑部定位性损坏造成的相应表现；少数患者可致死或留有后遗症。广州管圆线虫病已被世界公认为新流行或者再流行的人兽共患寄生虫病，我国卫生部也在2003年将其列为新发传染病。确诊广州管圆线虫病需在病人脑脊液或者其他组织中找到虫体，但检出率只有百分之十左右。通常该病需要依靠临床症状、流行病学资料和免疫学进行综合诊断。目前实验室检查主要有以下几种途径:
一、血液常规检查:白细胞总数正常或增加，嗜酸性粒细胞可有不同程度的增多。
[0003]二、脑脊液检查:脑脊液压力增高，白细胞数量及蛋白含量增加；嗜酸性粒细胞增多。糖、氯化物无明显变化。极少数病例可找见幼虫或成虫。
[0004]三、免疫学检查:常用的方法为酶联免疫吸附试验，抗体阳性可做为辅助诊断。
[0005]四、病原学检查:从脑脊液、眼或其他寄生部位查见本虫幼虫或成虫，但阳性机率极小。
[0006]五、影像学检查:`头颅MRI表现多种多样，脑脊髓内多发长条形或结节强化病灶和软脑膜强化是主要的表现。
[0007]众所周知，广州管圆线虫病的免疫诊断最主要是用ELISA法检测病人血清中特异性抗体(蛋白质水平)。而microRNA的变化早于蛋白质变化和临床症状的出现，因此适合于疾病的早期诊断。另外由于取材方便，血清或者脑脊液中的microRNA比组织的microRNA具有更好的应用前景。microRNA是一种长度20~24nt单链小分子RNA，它广泛存在于各种真核细胞生物中表达具时序性和组织特异性，在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用。miCToRNA释放进入外周循环的途径目前主要考虑有从受损细胞渗透入循环，形成微泡进入循环，由细胞分泌进入循环三种不同的途径。miCToRNA耐RNA酶降解，在血清或者脑脊液中可以长期稳定存在，煮沸、反复冻融、酸碱环境及长期保存等方法均不会损失。目前国外相关研究发现miR-Ι对于急性心肌梗塞有诊断价值;miR-15、miR-16可用于慢性淋巴细胞性白血病的诊断；Let-7对非小细胞肺癌有诊断意义；miR-134可作为肺栓塞的诊断标志物。
[0008]miR-146a-5p是一种典型的多功能基因，由其下游基因介导，参与各种生理病理过程，如炎症，免疫及肿瘤的发生发展。虽然microRNA在各种物种间有较高的保守性，即不同物种间的序列相似，但却不完全相同。
【发明内容】
[0009]本发明的目的之一在于提供一种虫源性的HiiCT0RNA作为广州管圆线虫病早期诊断的分子标志物。
[0010]本发明的另一个目的在于提供用于检测广州管圆线虫病的引物。
[0011]本发明的目的之三在于提供检测所采用的引物及分子生物学方法。
[0012]首先，发明提供了一种与广州管圆线虫病检测相关的分子标记物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0013]同时，发明提供了一种用于检测广州管圆线虫病的引物，其特征在于所述引物序列如 SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3 和 / 或 SEQ ID NO:4 所示。
[0014]如SEQ ID NO:1 所示基因，或者如 SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 和 / 或 SEQ ID NO:4所示引物，可用于制备广州管圆线虫病检测试剂。
[0015]发明同时提供了一种广州管圆线虫病检测试剂盒，其特征在于含有如SEQ IDNO:2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4所示的引物。同时，该试剂盒其特征在于其扩增产物中还可含有aca-miR-146a_5p。
[0016]本发明通过数据库mirbase中各种物种的miR-146a_5p进行序列比对,发现广州管圆线虫虫源性 miR-146a-5p (aca-miR-146a_5p)序列为是 UGAGAACUGAAUUCCAUAGGC，而人源性 miR-146a-5p (hs a-miR-146a_5p)序列为 UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU，鉴于两者序列末端相差较大，可以利用特别设计的三个引物(包括茎环引物、上游引物和下游引物)来鉴另1J。实验证实，aca-miR-146a-5p是检测人感染广州管圆线虫的有效标记物；而利用本发明所采用的引物，可以高特异性地检测出相关疾病，准确率达96%。
[0017]本发明基于上述分子标记物和引物的设计，广州管圆线虫感染的检测方法基本为:在人体血液中检测到较高表达量的aca-miR-146a-5p，即可诊断此患者被广州管圆线虫感染；在脑脊液中检测到较高表达量的aca-miR-146a-5p，即可诊断为广州管圆线虫感染引起的脑膜炎或者脑炎。
[0018]更具体地说，其步骤为提取疑似病人和正常人的血清(或脑脊液)中的总RNA然后用本发明中的特异性茎环引物逆转录成CDNA然后在用一对特异性引物进行实时定量PCR,以RNU6做为内参，根据检测结果判断疑似病人有无广州管圆线虫感染。本发明可以用于制作诊断试剂盒。
[0019]本发明公开了 aca-miR-146a_5p在广州管圆线虫病中的诊断新方法。该诊断试剂的必要组成包含:aca-miR-146a-5p序列及根据该序列设计的相应的三条引物(茎环引物，上下游引物)。本发明是首次提出将aca-miR-146a-5p应用于制备抗广州管圆线虫病的诊断。该诊断试剂具有早期、准确、简易的检测出广州管圆线虫感染，能把广州管圆线虫感染引起的脑膜炎或者脑炎和其他脑膜炎或者脑炎鉴别的优点，具有很好的社会和经济效益。
[0020]本发明具有以下有益效果:
采用本发明的分子标记物及相关引物，可准确地判断出检测对象是否受广州管圆线虫感染，准确率高达96%。
[0021]本发明的相关方法可早期、准确、简易地检测出广州管圆线虫感染，感染3d的病人即可在血液中检测到aca-miR-146a-5p的表达增高5倍以上，从而及早治疗，减轻临床症状、减少并发症和后遗症。[0022]本发明的相关方法能把广州管圆线虫感染引起的脑膜炎或者脑炎和其他脑膜炎或者脑炎鉴别，在广州管圆线虫感染患者的脑脊液中，aca-miR-146a-5p表达量明显增高，增高5倍以上,而在其他脑炎和其他脑膜炎感染患者中，aca-miR-146a-5p不出现增高,从而可以加以区别，进而采取有效的治疗方案。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为实时定量荧光PCR扩增曲线:图示为标准的microRNA荧光PCR扩增曲线； 图2实时荧光定量PCR溶解曲线:图示中的溶解曲线为单峰，说明所用引物特异性好。
【具体实施方式】
[0024]下面通过具体的实施方式的描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。
[0025]实施例1 引物设计
在microRNA数据库mirbase检索得到广州管圆线虫虫源性miR-146a_5p(aca-miR-146a-5p)序列为 SEQ ID NO:1 (UGAGAACUGAAUUCCAUAGGC)。
[0026]设计带有茎环的逆转录引物SEQID NO:2:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTATGG
实时PCR的上下游引物分别为:
上游引物 SEQ ID NO:3:ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCC
下游引物 SEQ ID NO:4:TGGTGTCGTGGAGTCG
实施例2
血清或者脑脊液总RNA的抽提
取200微升血清或者脑脊液至无RNA酶EP管中，12000rpm, 4°C离心10分钟，转移上清至另一去RNA酶EP管中，加入I毫升trizol，剧烈震荡五分钟，加入氯烷200微升，混匀后常温下静置十分钟，12000rpm，4°C离心15分钟，转移上清另一去RNA酶EP管中，加入等体积异丙醇，混匀后常温下静置15分钟，再置于4°C温度下静置35分钟，12000rpm，4°C离心10分钟，轻轻倒弃上清，然后用75%的乙醇洗涤沉淀后7200rpm，4°C离心10分钟，弃风干10分钟后加入20微升经cbpc处理水溶解沉淀。
[0027]实施例3
由广州管圆线虫引起的脑部病变需要与病毒性脑膜脑炎，结核性脑膜脑炎以及其他脑寄生虫病的鉴别:从确诊广州管圆线虫感染病人30例及对照组30例(病毒性脑膜脑炎，结核性脑膜脑炎和其他脑寄生虫病病人各10例)腰穿得到一毫升左右脑脊液，按照实施例2中提供的方法提取RNA后逆转录成CDNA，然后进行实时定量荧光PCR，实时荧光定量PCR的反应条件为:预变性95°C，时间为IOmin ;变性95°C，时间为15sec，退火温度为60°C，时间为30sec，延伸温度72°C，时间为15sec，循环数为40 ;每个样品进行复孔测试，每次检测反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析，检测温度为70°C°C，升温速率为0.4/ °〇次，恒温时间为I sec/次。结果显示:实时定量荧光PCR的溶解曲线为单峰(如图2所示)，按照本试剂盒提供的诊断标准，即aca-miR-146a-5p表达量是标准阴性样品五倍或者以上的可诊断为广州管圆线虫病引起的脑膜炎或者脑炎，本实验得出该检验方法的敏感性和特异性分别为96%和94%。
[0028] 实施例4 通过血清早期诊断广州管圆线虫病
从确诊广州管圆线虫感染病人50例及正常对照组50人静脉抽血一毫升左右，不抗凝常温放置四个小时，7500rpm，离心五分钟，上清液即为血清，吸取100微升血清按照实施例2中提供的方法提取RNA，然后进行逆转录然后按照实施例3提供的方法进行实时定量荧光PCR,按照本试剂盒提供的诊断标准，即aca-miR-146a-5p表达量是标准阴性样品五倍或者以上的可诊断为广州管圆线虫病，本实验得出敏感性和特异性分别为96%和92%。
【权利要求】
1.一种与广州管圆线虫病检测相关的分子标记物，其特征在于所述标记物核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一种用于检测广州管圆线虫病的引物，其特征在于所述引物序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 和 / 或 SEQ ID NO:4 所示。
3.如SEQID NO:1所示基因在作为广州管圆线虫病分子标记物上的应用。
4.如SEQID NO:1所示基因在制备广州管圆线虫病检测试剂中的应用。
5.如SEQID NO:2, SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4所示引物在制备广州管圆线虫病检测试剂中的应用。
6.一种广州管圆线虫病检测试剂盒，其特征在于含有如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:4所示的引物。
7.一种广州管圆线虫病 检测试剂盒，其特征在于其扩增产物中含有aca-miR-146a_5p。
【文档编号】C12Q1/68GK103695532SQ201310491375
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】陈小光, 孙希, 吴忠道 申请人:中山大学