一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离dna和rna的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离DNA和RNA的试剂盒及方法。本发明所述试剂盒可用于FFPE样本中DNA和RNA的同时提取，其优点不仅在于可以同时进行核酸提取，节省时间，经济，快速，而且本发明可节约样本量，能有效解决试验中缺少样本的难题，还可以保证研究中使用的DNA和RNA的来源完全相同。本发明操作简捷，重复性高，得率高，2～5片肿瘤组织切片即可同时获得足够的DNA和RNA；获得的核酸纯度高，对后续的检测无干扰；与常用试剂盒相比，具有明显的优势。
【专利说明】—种从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离DNA和RNA的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及一种共分离福尔马林固定石蜡包埋组织样本DNA和RNA的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，核酸就成为了生物学的研究重点，并产生了以DNA和RNA为主要研究对象的分子生物学学科，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组的变化积累了新资料。福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffin embedded tissues,FFPE,以下简称 FFPE)是医疗机构最常用的保存病理组织的方法。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。由于新鲜标本难以得到，为进行实体肿瘤分子生物学研究，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行基因提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。从FFPE样品中分离出高纯度高质量的核酸是下游试验顺利进行的最基本前提。传统方法中DNA和RNA的分离纯化绝大部分都是单独进行的，同时提取DNA和RNA的方法较少，纯度也低，耗时长，难以满足下游试验的要求。文献中报道的提取方法主要有酚氯仿抽提法，离子交换法，盐析法，硅胶柱法等，但这些方法往往只能提取出其中一种核酸而浪费另一种核酸，且需使用到一些有毒试剂，如苯酚、氯仿等，不利于实验人员的身体健康。临床上的分子生物学研究往往需要同时提取DNA和RNA，当样本有限时，则可能影响下游试验的进行。
[0003]因此，临床上迫切需要一种能够从FFPE样本中共分离DNA和RNA的试剂盒及方法，所提DNA和RNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下下游试验的正常进行；并可以保证研究中使用的DNA 和RNA的来源完全相同。因为现在很多研究者想比较DNA和RNA用于检测或者研究中的差别，但是由于肿瘤的异质性等问题，结论并不能完全信服，也有所出入。
【发明内容】
[0004]针对上述问题，本发明的目的在于提供了一种从FFPE样本中共分离DNA和RNA的试剂盒，采用本试剂盒提取DNA和RNA含量高，纯度高，操作简捷，重复性高，节省样本量。
[0005]本发明的另一个目的在于提供了一种从FFPE样本中共分离DNA和RNA的方法，该方法所需样本量少，所提取DNA和RNA的含量和纯度高，不需要接触酚、氯仿、异戊醇等有毒有害物质，操作过程简便快捷。
[0006]本发明所述从FFPE样本中共分离DNA和RNA的试剂盒包括:
[0007]①RNA分离所需的裂解液Buffer RTL、结合液Buffer RTB,DNase I工作混合液、漂洗液Buffer RTW和洗脱液Buffer RTE。所述 Buffer RTL包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl,0.8 ~1.2M 的 NaCl,8 ~14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠；所述Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris ?Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~1.2M 的 KCl，0.4 ~
1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸钠，8 ~16%(V/V)的 Tween20，4 ~6M 的异硫氰酸狐；所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer(50~150mM的Tris.Cl,30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgC12)及 DNase I (1-5U/ μ L);所述漂洗液 Buffer RTff包含 250 ~350mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM 的 EDTA，0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；所述洗脱液 Buffer RTE 包含 10 ~20mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA。
[0008]优选地，所述Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V)Tween20,
0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0009]优选地，所述Buffer RTB 包含 IOOmM 的 Tris *Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的NaCl,0.2% (V/V)的十二烷基硫酸钠，10% (V/V)的Tween20，6M的异硫氰酸胍；
[0010]优选地，所述漂洗液Buffer RTff中，包含300mM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的NaCl，80%的乙醇；
[0011]优选地，本发明所述DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.Cl,50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2)与 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0012]本发明所述结合液·Buffer RTB，其中十二烷基硫酸钠、TWeen20能够有效提高RNA得率。
[0013]②DNA分离所需的裂解液Buffer DTL、调节液Buffer DES、结合液Buffer DTB、漂洗液Buffer Dffl和DW2、洗脱液Buffer DTE。所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，10 ~25% (V/V)的 Tween20 ;所述调节液 Buffer DES 包含所述 80 ~150mM 的 Tris.Cl,30 ~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;所述结合液 Buffer DTB包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，4~6M的异硫氰酸胍；所述Buffer Dffl包含150~400mM的Tris ?Cl, 40~IOOmM的EDTA，2~5M的异硫氰酸胍,40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris.Cl，0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA。
[0014]优选地，所述Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ；
[0015]优选地，所述调节液Buffer DES中包含IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，
0.8M (NH4)2SO4 ；
[0016]优选地，所述结合液Buffer DTB中包含IOOmM的Tris *Cl,50mM的EDTA，0.8M的KCl，5M的异硫氰酸胍；
[0017]优选地，所述洗涤液Buffer Dffl中包含300mM的Tris *Cl,50mM的EDTA，3M的异硫氰酸胍，56%的乙醇；
[0018]优选地，所述漂洗液Buffer DW2中包含500mM的Tris.Cl, IM的NaCl，80%的乙醇；
[0019]本发明所述调节液Buffer DES的主要作用是进一步减少DNA~蛋白的交联作用，减少核酸的片段化，增加核酸的有效浓度。 0]本发明还提供了一种从FFPE样本中共分离DNA和RNA的方法，包括以下步骤:
[0021]步骤1.脱蜡
[0022](I)根据FFPE切片组织面积的大小，刮取2~5片FFPE样品至1.5mL离心管中；加入ImL 二甲苯,振荡混匀5~30s ；
[0023](2)室温10000~16000rpm离心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0024](3)加入ImL无水乙醇，振荡混匀5~30s ;室温下10000~16000rpm离心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0025](4)室温开盖放置IOmin或37°C下开盖放置5min，使乙醇充分挥发。
[0026]步骤2.组织的裂解
[0027](I)加入 200 μ LBuffer RTL 及 25 μ L Proteinase K Solution，使用移液器吹打混匀，50~60°C消化10~30min ；
[0028](2) 10000~16000rpm离心2~IOmin,将180 μ L上清液转移至干净的1.5mL离心管中用于分离RNA，剩余液体及沉淀用于分离DNA。
[0029]步骤3.DNA分离
[0030](I)加入 140 μ L Buffer DTL及 15 μ LProteinase K Solution 至剩余液体和沉淀中，使用移液器吹打混匀，50~60°C消化20min~12h ；
[0031](2)加入10 μ L Buffer DES，混匀后放入温度已升至85~95°C的恒温加热器中，孵育I~3h ;
[0032](3)用掌式离心机离心5~10s。如有需要，可待液体温度降至室温，加入2 μ L100mg/mL RNase A,室温放置 3 ~IOmin 以去除 RNA ；
[0033](4)加入200 μ L Buffer DTB和200 μ L无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心5 ~IOs ；
[0034](5)将全部液体转移至DNA吸附柱中，6000~12000rpm离心30s~2min，倒掉收集管中的液体；
[0035](6)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW1，6000 ~12000rpm 离心 30s ~2min，
倒掉收集管中的液体；
[0036](7)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW2，6000 ~12000rpm 离心 30s ~2min，
丢弃收集管；
[0037](8)换用新的收集管，10000~16000rpm离心I~5min,丢弃收集管；
[0038](9)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往DNA吸附膜中心滴加30~100 μ L Buffer DTE(勿碰到DNA吸附膜)，室温静置I~3min，10000~16000rpm离心30s~20min，收集样品DNA并保存；注:适当降低洗脱体积可以提高样品核酸的浓度。
[0039](10)所分离的DNA建议马上使用，如超过6h未使用，请于~20±5°C冷冻保存。
[0040]步骤4.RNA分离
[0041](I)将含180 μ L上清液的离心管转移到温度已升至75~85°C的恒温加热器中，孵育15min ；
[0042](2)待液体温度降至室温，用掌式离心机离心5~IOs ;
[0043](3)加入30 μ LDNase I工作混合液至样品中，使用移液器吹打混匀，室温静置15min ；
[0044](4)加入340 μ L Buffer RTB和750 μ L无水乙醇，上下颠倒混匀后用掌式离心机离心5~IOs ；
[0045](5)将650 μ L液体转移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm离心10~60s,倒掉
收集管中的液体；
[0046](6)将剩余液体全部转移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm离心10~60s,倒掉
收集管中的液体；
[0047](7)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 离心 10 ~60s，
倒掉收集管中的液体；
[0048](8)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 离心 10 ~60s，
丢弃收集管；
[0049](9)换用新的收集管，10000~16000rpm离心3~IOmin,丢弃收集管；
[0050](10)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ L Buffer RTE(勿碰到RNA吸附膜)，室温静置I~3min，10000~16000rpm离心30s~20min，收集样品RNA ;注:适当降低洗脱体积可以提高样品核酸的浓度。
[0051](11)所分离的RNA建议马上使用，如超过2h未使用，请于~70°C以下保存。
[0052]其中，步骤2所述加入的Buffer RTL包含150~300mM的Tris.C1，0.8~1.2M的NaCl,8~14% (V/V) Tween20,0.2~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠，作为优选，采用的Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0053]其中，步骤2所述加入的Buffer RTL与Proteinase K Solution比例为8:1,使用移液器吹打混匀；
[0054]其中，步骤3所述加入的Buffer DTL包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，10~25% (V/V)的Tween20，作为优选，采用的 Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ;
[0055]其中，步骤3所述加入的调节液Buffer DES包含80~150mM的Tris.Cl，30~70mM 的 EDTA, 0.4 ~1.5M 的(NH4) 2S04,0.8 ~1.5M 的 KCl ;作为优选，Buffer DES 包含 IOOmM的 Tris.Cl,50mM 的 EDTA，0.8M 的(NH4)2SO4, IM 的 KCl ；
[0056]其中，步骤3所述加入的结合液Buffer DTB包括80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，4~6M的异硫氰酸胍；作为优选,Buffer DTB包括IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，0.8M的KCl，采用的异硫氰酸胍浓度为5M ；
[0057]其中，步骤3所述加入的Buffer DWl包含150~400mM的Tris.Cl，40~IOOmM的EDTA, 2~5M的异硫氰酸胍，40~70%乙醇；作为优选，Buffer Dffl包含300mM的Tris ?Cl,50mM的EDTA，3M的异硫氰酸胍，采用的乙醇浓度为56% ；Buffer DW2包含300~700mM的 Tris.Cl，0.8 ~L 2M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；作为优选，Buffer DW2 包含 500mM 的Tris.Cl，IM的NaCl，采用的乙醇浓度为80% ；
[0058]其中，步骤3所 述加入的漂洗液所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5 ~IOmM 的 EDTA。[0059]其中，步骤4所述加入的的DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.Cl,50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2)与 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0060]其中，步骤4所述加入的的Buffer RTB包含50~150mM的Tris.Cl，150~250mM的 EDTA,0.8 ~1.2M 的 KCl,0.4 ~1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸钠，8 ~16% (V/V)的Tween20，4~6M的异硫氰酸胍；作为优选，采用的Buffer RTB包含200mM的Tris.Cl，IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0061]其中，步骤4所述加入的Buffer RTB和无水乙醇的混合比例为50~60%，上下颠倒混匀；优选地，混合比例为58% ； [0062]其中，步骤4所述加入的的漂洗液Buffer RTW包含250~350mM的Tris.Cl，30 ~70mM 的 EDTA，0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；作为优选，Buffer RTW 包含 300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，IM的NaCl，采用的乙醇浓度为80% ；
[0063]其中，步骤4所述加入的的洗脱液Buffer RTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~20mM 的 EDTA。
[0064]本发明采用高效核酸裂解系统，从少量样品中快速高效的释放DNA和RNA，通过高温修复作用修复FFPE样品中核酸的交联化，采用硅胶膜吸附技术，4.5小时内即可完成FFPE样品中DNA和RNA的分离和纯化工作，获得高质量的核酸。该方法操作简捷，重复性高，得率高，I~3片肿瘤组织切片即可同时获得足够的DNA和RNA ;获得的核酸纯度高，对后续的检测无干扰。与常用试剂盒相比，具有明显的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1DNA检测紫外吸收峰图
[0066]图2RNA检测紫外吸收峰图
[0067]图3本发明试剂盒与常用试剂盒所提取核酸PCR对照图【具体实施方式】
[0068]依照本发明，所述从FFPE样本中共分离DNA和RNA的试剂盒包括:
[0069]①RNA分离所需的裂解液Buffer RTL、结合液Buffer RTB,DNase I工作混合液、漂洗液Buffer RTW和洗脱液Buffer RTE。所述 Buffer RTL包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl,
0.8 ~1.2M 的 NaCl，8 ~14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠；所述Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris ?Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~1.2M 的 KCl，0.4 ~
1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸钠，8 ~16%(V/V)的 Tween20，4 ~6M 的异硫氰酸狐；所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer(50~150mM的Tris.Cl,30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgCl2)及 DNase I (3U/ μ L);所述漂洗液 Buffer RTff包含 300mM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；所述洗脱液 Buffer RTE包含 IOmM 的 Tris.Cl，5mM 的 EDTA。
[0070]优选地，所述Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V)Tween20,
0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0071]优选地，所述Buffer RTB 包括 IOOmM 的 Tris *Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的NaCl,0.2% (V/V)的十二烷基硫酸钠，10% (V/V)的Tween20，6M的异硫氰酸胍；
[0072]优选地，所述漂洗液Buffer RTff中，包含300mM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的NaCl，乙醇浓度为80%
[0073]优选地，本发明所述DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer er (IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 NaCl ;80mM 的 MgCl2)与 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0074]本发明所述结合液Buffer RTB，其中十二烷基硫酸钠、TWeen20能够有效提高RNA得率。
[0075]②DNA分离所需的裂解液Buffer DTL、调节液Buffer DES、结合液Buffer DTB、漂洗液Buffer Dffl和DW2、洗脱液Buffer DTE。所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，10 ~25% (V/V)的 Tween20 ;所述调节液 Buffer DES 包含所述 80 ~150mM 的 Tris.Cl,30 ~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;所述结合液 Buffer DTB包括80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，3~6M的异硫氰酸胍；所述Buffer Dffl包含150~400mM的Tris ?Cl, 40~IOOmM的EDTA，2~5M的异硫氰酸胍,40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris.Cl,0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~20mM的EDTA。
[0076]优选地，所述Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ；
[0077]优选地，所述调节液Buffer DES中包含IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，IM的KCl，(NH4)2SO4 浓度为 0.8M;
[0078]优选地，所述结合液Buffer DTB中包含IOOmM的Tris *Cl,50mM的EDTA，0.8M的KCl，异硫氰酸胍浓度为5M ；
[0079]优选地，所述洗涤液Buffer Dffl中包含300mM的Tris *Cl,50mM的EDTA，3M的异硫氰酸胍，乙醇体积比为56% ；
[0080]优选地，所述漂洗液Buffer Dff2中包含500mM的Tris.Cl, IM的NaCl,乙醇体积比为80% ；
[0081]本发明所述调节液Buffer DES的主要作用是进一步减少DNA~蛋白的交联作用，减少核酸的片段化，增加核酸的有效浓度。
[0082]本发明还提供了一种从FFPE样本中共分离DNA和RNA的方法，包括以下步骤:
[0083]步骤1.脱蜡
[0084](I)根据FFPE切片组织面积的大小，刮取2~5片FFPE样品至1.5mL离心管中；加入ImL 二甲苯,振荡混匀5~30s ；
[0085](2)室温10000~16000rpm离心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0086](3)加入ImL无水乙醇，振荡混匀5~30s ;室温下10000~16000rpm离心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0087](4)室温开盖放置IOmin或37°C下开盖放置5min，使乙醇充分挥发。
[0088]步骤2.组织的裂解[0089](I)加入 200 μ L Buffer RTL 及 25 μ L Proteinase K Solution，使用移液器吹打混匀，50~60°C消化10~30min ；
[0090](2) 10000~16000rpm离心2min，将180 μ L上清液转移至干净的1.5mL离心管中用于分离RNA，剩余液体及沉淀用于分离DNA。
[0091]步骤3.DNA分离
[0092](I)加入 140 μ L Buffer DTL 及 15 μ L Proteinase K Solution 至剩余液体和沉淀中，使用移液器吹打混匀，50~60°C消化20min~12h ；
[0093](2)加入10 μ L Buffer DES，混匀后放入温度已升至85~95°C的恒温加热器中，孵育I~3h ;
[0094](3)用掌式离心机离心5~10s。如有需要，可待液体温度降至室温，加入2 μ L100mg/mL RNase A,室温放置 3 ~IOmin 以去除 RNA ；
[0095](4)加入200 μ L Buffer DTB和200 μ L无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心5 ~IOs ；
[0096](5)将全部液体转移至DNA吸附柱中，6000~12000rpm离心30s~2min，倒掉收集管中的液体；
[0097](6)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW1，6000 ~12000rpm 离心 30s ~2min，
倒掉收集管中的液体；
[0098](7)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW2，6000 ~12000rpm 离心 30s ~2min，
丢弃收集管；
[0099](8)换用新的收集管，10000~16000rpm离心I~5min,丢弃收集管；
[0100](9)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往DNA吸附膜中心滴加30~100 μ L Buffer DTE(勿碰到DNA吸附膜)，室温静置I~3min，10000~16000rpm离心30s~20min，收集样品DNA并保存；注:适当降低洗脱体积可以提高样品核酸的浓度。
[0101](10)所分离的DNA建议马上使用，如超过6h未使用，请于~20±5°C冷冻保存。
[0102]步骤4.RNA分离
[0103](I)将含180 μ L上清液的离心管转移到温度已升至75~85°C的恒温加热器中，孵育15min ；
[0104](2)待液体温度 降至室温，用掌式离心机离心5~IOs ;
[0105](3)加入30 μ LDNase I工作混合液至样品中，使用移液器吹打混匀，室温静置15min ；
[0106](4)加入340 μ L Buffer RTB和750 μ L无水乙醇，上下颠倒混匀后用掌式离心机离心5~IOs ；
[0107](5)将650 μ L液体转移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm离心10~60s,倒掉
收集管中的液体；
[0108](6)将剩余液体全部转移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm离心10~60s,倒掉
收集管中的液体；
[0109](7)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 离心 10 ~60s，
倒掉收集管中的液体；
[0110](8)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 离心 10 ~60s，丢弃收集管；
[0111](9)换用新的收集管，10000~16000rpm离心3~1Omin,丢弃收集管；
[0112](10)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ L Buffer RTE(勿碰到RNA吸附膜)，室温静置1~3min，10000~16000rpm离心30s~20min，收集样品RNA ;注:适当降低洗脱体积可以提高样品核酸的浓度。
[0113](11)所分离的RNA建议马上使用，如超过2h未使用，请于~70°C以下保存。
[0114]其中，步骤2所述加入的Buffer RTL包含150~300mM的Tris.Cl，0.8~1.2M的NaCl,8~14% (V/V) Tween20,0.2~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠，作为优选，采用的Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0115]其中，步骤2所述加入的Buffer RTL与Proteinase K Solution比例为8:1,使用移液器吹打混匀；
[0116]其中，步骤3所述加入的Buffer DTL包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，10~25% (V/V)的Tween20，作为优选，采用的 Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ;
[0117]其中，步骤3所述加入的调节液Buffer DES包含80~150mM的Tris.Cl，30~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;作为优选，采用的 Buffer DES包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 KCl，(NH4)2SO4 浓度为 0.8M ；
[0118]其中，步骤3所述加入的结合液Buffer DTB包括80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2mM的KC1，4~6M的异硫氰酸胍；作为优选，采用的Buffer DTB包括IOOmM的Tris.Cl,50mM的EDTA，800mM的KC1，异硫氰酸胍浓度为5M ；
[0119]其中，步骤3所述加入的Buffer Dffl包含150~400mM的Tris.Cl，40~IOOmM的EDTA，2~5M的异硫氰酸胍，40~70%乙醇；作为优选，采用的Buffer Dffl包含300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，3M的异硫氰酸胍，乙醇浓度为56% ；Buffer DW2包含300~700mM的Tris ?Cl, 0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；作为优选，采用的Buffer DW2包含500mM的Tris.Cl，IM的NaCl，乙醇浓度为80% ；
[0120]其中，步骤3所述加入的漂洗液所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5 ~IOmM 的 EDTA。
[0121]其中，步骤4所述加入的的DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.α，50πm 的 NaCl ;80mM 的 MgC12)与 10 μ L DNase I (3U/yL)的比例配制成的；
[0122]其中，步骤4所述加入的的Buffer RTB包含50~150mM的Tris.Cl，150~250mM的 EDTA,0.8 ~1.2M 的 KCl,0.4 ~1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸钠，8 ~16% (V/V)的Tween20，4~6M的异硫氰酸胍；作为优选，采用的Buffer RTB包含200mM的Tris.Cl，IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0123]其中步骤4所述加入的Buffer RTB和无水乙醇的混合比例为50~60%，上下颠倒混匀；优选地，混合比例为58% ；
[0124]其中，步骤4所述加入的的漂洗液Buffer RTW包含250~350mM的Tris.Cl，30~70mM的EDTA，0.5~1.5M的NaCl，70~85%乙醇；作为优选，采用的Buffer RTff包含300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，IM的NaCl，乙醇浓度为80% ;其中，步骤4所述加入的的洗脱液 Buffer RTE 包含 10 ~20mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA。
[0125]采用本试剂盒所述方法，其提取过程应使用一次性无DNase和RNase的移液器枪头和离心管；用于核酸分离的FFPE样本的组织面积应介于0.5~1cm2，厚度应介于5~10 μ m ；
[0126]本发明所述方法可用于所有FFPE样本，4.5小时内即可完成FFPE样品中DNA和RNA的分离和纯化工作，获得高质量的核酸。相比常见的离心柱提取法，提取时间缩短，获得的核酸得率高、纯度高。
[0127]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
[0128]实施例1:本发明所述试剂盒
[0129]所述从FFPE样本中共分离DNA和RNA的试剂盒包括:
[0130]①RNA分离所需的裂解液Buffer RTL、结合液Buffer RTB,DNase I工作混合液、漂洗液Buffer RTW和洗脱液Buffer RTE。所述 Buffer RTL包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl,
0.8 ~1.2M 的 NaCl，8 ~14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠；所述Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris ?Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~1.2M 的 KCl，0.4 ~
1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸钠，8 ~16%(V/V)的 Tween20，4 ~6M 的异硫氰酸狐；所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer(80~120mM的Tris.Cl,30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgCl2)及 DNase I (3U/ μ L);所述漂洗液 Buffer RTff包含 250 ~350mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM 的 EDTA，0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~85% 乙醇；所述洗脱液 Buffer RTE 包含 10 ~20mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA。
[0131]优选地，所述Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V)Tween20,
0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0132]优选地，所述Buffer RTB 包括 IOOmM 的 Tris *Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的NaCl,0.2% (V/V)的十二烷基硫酸钠，10% (V/V)的Tween20，6M的异硫氰酸胍；
[0133]优选地，所述漂洗液Buffer RTff中，包含300mM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的NaCl，乙醇浓度为80% ；
[0134]优选地，本发明所述DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.Cl,50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2)与 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0135] 本发明所述结合液Buffer RTB，其中十二烷基硫酸钠、TWeen20能够有效提高RNA
得率
[0136]②DNA分离所需的裂解液Buffer DTL、调节液Buffer DES、结合液Buffer DTB、漂洗液Buffer Dffl和DW2、洗脱液Buffer DTE。所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，10 ~25% (V/V)的 Tween20 ;所述调节液 Buffer DES 包含所述 80 ~150mM 的 Tris.Cl,30 ~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;所述结合液 Buffer DTB包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，4~6M的异硫氰酸胍；所述Buffer Dffl包含150~450mM的Tris ?Cl, 40~IOOmM的EDTA，2~5M的异硫氰酸胍,40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris.Cl,0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA。
[0137]优选地，所述Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ；
[0138]优选地，所述调节液Buffer DES中包含IOOmM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的KCl，(NH4)2SO4 浓度为 0.8M;
[0139]优选地，所述结合液Buffer DTB中包含IOOmM的Tris *Cl,50mM的EDTA，0.8M的KCl异硫氰酸胍浓度为5M ；
[0140]优选地，所述洗涤液Buffer Dffl中包含300mM的Tris *Cl,50mM的EDTA，3M的异硫氰酸胍，乙醇体积比为56% ； [0141]优选地，所述漂洗液Buffer Dff2中包含500mM的Tris.Cl, IM的NaCl,乙醇体积比为80% ；
[0142]本发明所述调节液Buffer DES的主要作用是进一步减少DNA~蛋白的交联作用，减少核酸的片段化，增加核酸的有效浓度。
[0143]实施例2
[0144]采用实施例1所述试剂盒，对120例样品共分离DNA和RNA，并与常用试剂盒进行平行对比，样品为3年内的石蜡包埋临床样本，包括肺癌、肝癌、结直肠癌等。
[0145]1、提取试剂
[0146](I) RNA 分离
[0147]裂解液Buffer RTL:200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 EDTA，200mM 的二硫苏糖醇，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；
[0148]结合液Buffer RTB:100mM 的 Tris.Cl，200mM 的 EDTA，IM 的 KC1，IM 的 NaCl，0.2%(V/V)的十二烷基硫酸钠，10% (V/V)的Tween20，6M的异硫氰酸胍；
[0149]DNase I 工作混合液:DNase I Magic Buffer (IOOmM 的 Tris.Cl, 50mM 的 NaCl,80mM 的 MgCl2), DNase I (3U/y L)；
[0150]漂洗液Buffer RTff:300mM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 NaCl，10% 乙醇；
[0151]洗脱液Buffer RTE:10mM 的 Tris.Cl，5mM 的 EDTA。
[0152](2) DNA 分离
[0153]裂解液Buffer DTL:100mM 的 Tris *Cl,50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5%(V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ；
[0154]调节液Buffer DES: IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，800mM 的(NH4) 2S04, IM 的KCl ；
[0155]结合液Buffer DTB:100mM 的 Tris.Cl,50mM 的 EDTA，800mM 的 KCl，5M 的异硫氰
酸胍；
[0156]漂洗液Buffer Dffl:300mM 的 Tris *Cl,50mM 的 EDTA，3M 的异硫氰酸胍，56% 乙醇；
[0157]漂洗液Buffer DW2:500mM 的 Tris.Cl，IM 的 NaCl，80% 乙醇；[0158]洗脱液Buffer DTE:10mM 的 Tris.Cl，5mM 的 EDTA。
[0159]2、提取方法
[0160]步骤1.脱蜡
[0161](I)根据FFPE切片组织面积的大小，刮取2~5片FFPE样品至1.5mL离心管中；加入ImL 二甲苯,振荡混匀IOs ；
[0162](2)室温HOOOrpm离心2min，小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0163](3)加入ImL无水乙醇,振荡混匀IOs ;室温下14000rpm离心2min,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0164](4)室温开盖放置IOmin或37°C下开盖放置5min，使乙醇充分挥发。
[0165]步骤2.组织的裂解
[0166](I)加入 200 μ L Buffer RTL 及 25 μ L Proteinase K Solution，使用移液器吹打混匀，56 °C消化15min ；
[0167](2) 14000rpm离心2min，将180 μ L上清液转移至干净的1.5mL离心管中用于分离RNA，剩余液体及沉淀用于分离DNA。
[0168]步骤3.DNA分离
[0169](I)加入 140 μ L Buffer DTL 及 15 μ L Proteinase K Solution 至剩余液体和沉淀中，使用移液器吹打混匀，56 V消化Ih ;
[0170](2)加入IOyL Buffer DES，混匀后放入温度已升至90°C的恒温加热器中，孵育2h ；
[0171](3)用掌式离心机离心5~10s。如有需要，可待液体温度降至室温，加入2 μ L100mg/mL RNase A,室温放置 5min 以去除 RNA ；
[0172](4)加入200 μ L Buffer DTB和200 μ L无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心5 ~IOs ；
[0173](5)将全部液体转移至DNA吸附柱中，8000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体；
[0174](6)往DNA吸附柱中加入600 μ L Buffer DW1，8000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体；
[0175](7)往DNA吸附柱中加入600 μ L Buffer DW2,8000rpm离心lmin,丢弃收集管；
[0176](8)换用新的收集管，14000rpm离心3min,丢弃收集管；
[0177](9)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往DNA吸附膜中心滴加30~100 μ L Buffer DTE (勿碰到DNA吸附膜),室温静置I~3min, 14000rpm离心lmin,收集样品DNA并保存；注:适当降低洗脱体积可以提高样品核酸的浓度。
[0178](10)所分离的DNA建议马上使用，如超过6h未使用，请于~20±5°C冷冻保存。步骤4.RNA分离
[0179](I)将含ISOyL上清液的离心管转移到温度已升至80°C的恒温加热器中，孵育15min ；
[0180](2)待液体温度降至室温，用掌式离心机离心5~IOs ;
[0181](3)加入30 μ LDNase I工作混合液至样品中，使用移液器吹打混匀，室温静置15min ；
[0182](4)加入340 μ L Buffer RTB和750 μ L无水乙醇，上下颠倒混匀后用掌式离心机离心5~IOs ；
[0183](5)将650 μ L液体转移至RNA吸附柱中，HOOOrpm离心30s，倒掉收集管中的液体；
[0184](6)将剩余液体全部转移至RNA吸附柱中，14000rpm离心30s,倒掉收集管中的液体；
[0185](7)往RNA吸附柱中加入600 μ L Buffer RTW，14000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体；
[0186](8)往RNA吸附柱中加入600 μ L Buffer RTff, 14000rpm离心30s，丢弃收集管；
[0187](9)换用新的收集管，14000rpm离心5min,丢弃收集管；
[0188](10)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ L Buffer RTE (勿碰到RNA吸附膜)，室温静置I~3min, 14000rpm离心lmin,收集样品RNA ;注:适当降低洗脱体积可以提高样品核酸的浓度。
[0189](11)所分离的RNA建议马上使用，如超过2h未使用，请于~70°C以下保存。
[0190]3、所提 DNA、RNA 含量及 0D260/280、0D260/230 值检测
[0191]采用分光光度计对本发明试剂盒提取的DNA、RNA进行含量及0D260/280、0D260/230值检测，结果如表1:
[0192]表1DNA、RNA 含量及 0D260/280、0D260/230 检测值
[0193]
【权利要求】
1.一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离DNA和RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: ①RNA分离所需的: 裂解液 Buffer RTL:所述 Buffer RTL 包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl，0.8 ~1.2M 的NaCl,8 ~ 14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠； 结合液 Buffer RTB:所述 Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris.Cl, 150 ~250mM 的EDTA,0.8 ~1.2M 的 KCl, 0.4 ~1.2M 的 NaCl, 0.1 ~0.5% (V/V)的十二烷基硫酸，8 ~16%(V/V)的Tween20，4~6M的异硫氰酸胍； DNase I工作混合液:所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer:80~120mM 的 Tris.Cl，30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgCl2 及 DNase Il-5U/y L ； 漂洗液 Buffer RTff:所述漂洗液 Buffer RTW包含 250 ~350mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM的 EDTA，0.5 ~L 5M 的 NaCl，70 ~90% 的乙醇； 洗脱液Buffer RTE:所述洗脱液Buffer RTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~20mM的EDTA ； ②DNA分离所需的: 裂解液Buffer DTL:所述Buffer DTL包含 80 ~150mM 的 Tris.Cl，40 ~70mM 的 EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，10~25% (V/V)的Tween20 ；调节液 Buffer DES:所述调节液 Buffer DES 包含 80 ~150mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM的 EDTA, 0.4 ~1.5M 的(NH4) 2S04,0.8 ~1.5M 的 KCl ；` 结合液 Buffer DTB:所述结合液 Buffer DTB 包含 80 ~150mM 的 Tris ?Cl, 40 ~70mM的EDTA，06~1.2M的KC1，4~6M的异硫氰酸胍； 漂洗液Buffer DWl 和 DW2:所述Buffer DWl 包含 150 ~400mM 的 Tris.Cl，40 ~IOOmM的EDTA，2~5M的异硫氰酸胍，40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的 Tris.C1，0.8 ~1.2M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇； 洗脱液Buffer DTE:所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述BufferRTL包含200mM的Tris ?Cl,IM的NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠；所述DNase I工作混合液是按每人份20μ? DNase I Magic Buffer与ΙΟμ? DNase I的比例配制成的；所述BufferRTB 包含 IOOmM 的 Tris.Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的 NaCl，0.2% (V/V)的十二烷基硫酸钠，10% (V/V)的Tween20，6M的异硫氰酸胍；所述漂洗液Buffer RTff中包含300mM的Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 NaCl，乙醇浓度为 80%。
3.根据权利要求2所述试剂盒,其特征在于,所述DNaseI工作混合液中，DNase IMagic Buffer 包括 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2, DNase I 浓度为 3U/μ L0
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述BufferDTL包含IOOmM的Tris.ClSOmM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5%(V/V)十二烷基硫酸钠，20%(V/V)的 Tween20 ；所述Buffer DES 中包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA, IM 的 KCl，(MM)2SO4浓度为 0.8M ；所述Buffer DTB中包含IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，0.8M的KCl，异硫氰酸胍浓度为.5M ;所述Buffer Dffl中包含300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，3M的异硫氰酸胍，乙醇体积比为56%, Buffer DW2中包含500mM的Tris.Cl，IM的NaCl，乙醇体积比为80%。
5.一种利用权利要求1所述试剂盒从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离DNA和RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1.脱蜡 (1)根据FFPE切片组织面积的大小，刮取2~5片FFPE样品至1.5mL离心管中；加入.1mL 二甲苯,振荡混匀5~30s ； (2)室温10000~16000rpm离心2~1Omin,小心去除上清； (3)加入1mL无水乙醇,振荡混匀5~30s;室温下10000~16000rpm离心2~1Omin,小心去除上清； (4)室温开盖放置或37°C下开盖放置，使乙醇充分挥发； 步骤2.组织的裂解 (1)加入200yL Buffer RTL 及 25yL Proteinase K Solution，使用移液器吹打混匀，.50 ~60°C消化 10 ~30min ;所述 Buffer RTL 包含 150 ~300mM 的 Tris.C1，0.8 ~1.2M的 NaCl,8 ~ 14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸钠； (2)10000~16000rpm离心2~IOmin,将180 μ L上清液转移至干净的1.5mL离心管中用于分离RNA，剩余液体及沉淀用于分离DNA ； 步骤3.DNA分离 (1)加入140yL Buffer DTL 及 15uL Proteinase K Solution 至剩余液体和沉淀中,使用移液器吹打混匀，50~60°C消化20min~12h ;所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫苏糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸钠，.10 ~25% (V/V)的 Tween20 ； (2)加入IOyLBuffer DES，混匀后放入温度已升至85~95°C的恒温加热器中，孵育.1~3h ;所述调节液Buffer DES包含所述80~150mM的Tris.Cl, 30~70mM的EDTA，.0.4 ~1.5M 的(NH4) 2S04,0.8 ~1.5M 的 KCl ； (3)用掌式离心机离心5~10s。如有需要，可待液体温度降至室温，加入2μ LlOOmg/mL RNase A，室温放置3~IOmin以去除RNA ； (4)加入200μ L Buffer DTB和200 μ L无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心5~.1Os ;所述结合液 Buffer DTB 包括 80 ~150mM 的 Tris.Cl，40 ~70mM 的 EDTA，0.6 ~1.2M的KC1，4~6M的异硫氰酸胍； (5)将全部液体转移至DNA吸附柱中,6000~12000rpm离心30s~2min,倒掉收集管中的液体； (6)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer Dff1,6000 ~12000rpm 离心 30s ~2min，倒掉收集管中的液体；所述Buffer Dffl包含150~400mM的Tris.Cl，40~IOOmM的EDTA，.2~5M的异硫氰酸胍，40~70%乙醇； (7)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW2，6000 ~12000rpm 离心 30s ~2min，丢弃收集管；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris *C1,0.8~1.2M的NaCl，70~.90%乙醇； (8)换用新的收集管，10000~16000rpm离心1~5min,丢弃收集管；(9)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往0嫩吸附膜中心滴加30~100 μ LBuffer DTE,室温静置1~3min，10000~16000rpm离心30s~2min，收集样品DNA并保存；所述洗脱液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA ； (10)所分离的DNA马上使用，如超过6h未使用，于~20±5°C冷冻保存； 步骤4.RNA分离 (1)将含180μ L上清液的离心管转移到温度已升至75~85°C的恒温加热器中，孵育10_20min ； (2)待液体温度降至室温，用掌式离心机离心5~IOs; (3)加入30μ LDNase I工作混合液至样品中，使用移液器吹打混匀，室温静置15min ；所述的DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I Magic Buffer与10 μ L DNase I的比例配制成的； (4)加入340μ L Buffer RTB和750 μ L无水乙醇，上下颠倒混匀后用掌式离心机离心 5 ~IOs ;所述 Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris.Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~.1.2M 的 KCl, 0.4 ~1.2M 的 NaCl, 0.1 ~0.5% (V/V)的十二烷基硫酸钠，8 ~16% (V/V)的Tween20,4~6M的异硫氰酸胍； (5)将650μ L液体转移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm离心10~60s，倒掉收集管中的液体； (6)将剩余液体全部转移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm离心10~60s,倒掉收集管中的液体；
(7)往RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 离心 10 ~60s,倒掉收集管中的液体；所述漂洗液Buffer RTff包含250~350mM的Tris.Cl，30~70mM的EDTA, 0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；
(8)往RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 离心 10 ~60s,丢弃收集管； (9)换用新的收集管，10000~16000rpm离心3~IOmin,丢弃收集管； (10)将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ LBuffer RTE,室温静置I~3min，10000~16000rpm离心30s~20min，收集样品RNA ;所述洗脱液 Buffer RTE 包含 10 ~50mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA ； (11)所分离的RNA马上使用，如超过2h未使用，于~70°C以下保存。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述裂解液BufferRTL包含200mM的Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10%(V/V)Tween20,0.5%(V/V)的十二烷基硫酸钠；所述结合液 BufferRTB 包含 IOOmM 的 Tris.Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的 NaCl，0.2% (V/V)的十二烷基硫酸钠，10% (V/V)的TWeen20，6M的异硫氰酸胍；所述漂洗液Buffer RTff中，乙醇浓度为80% ;所述 Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫苏糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸钠，20% (V/V)的Tween20 ;所述Buffer DES中(MM)2SO4浓度为0.8M ;所述Buffer DTB中异硫氰酸胍浓度为5M ;所述Buffer Dffl中乙醇浓度为56%，Buffer DW2中乙醇浓度为80%。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2所述加入的BufferRTL与Proteinase K Solution比例为8:1,使用移液器吹打混匀。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4加入的DNaseI工作混合液中，DNase I Magic Buffer 包括 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2, DNase I 浓度为3U/ μ L0
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4所述加入的BufferRTB和无水乙醇的混合比例为50~60%，上下颠倒混匀；优选地，混合比例为58%。
【文档编号】C12N15/10GK103725672SQ201310522206
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】刘云芬, 宋庆涛, 林清华, 李海燕, 阮力, 郑立谋 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司