重组瓜氨酸酶的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种重组瓜氨酸酶的制备方法：首先化学合成序列如SEQ?ID?No.1所示的CTU基因编码区DNA，再与表达载体pET-22b连接构建重组质粒pET-22b-ctu，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性克隆经诱导表达获得重组瓜氨酸酶；本发明成功合成并克隆了瓜氨酸酶的基因，构建了大肠杆菌的重组表达载体，在大肠杆菌中表达和分离纯化了重组瓜氨酸酶CTU；纯化的重组CTU经过体外测定，具有活性，可以将瓜氨酸分解成为鸟氨酸，为酶法制备鸟氨酸增加了一条新途径。
【专利说明】重组瓜氨酸酶的制备方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组瓜氨酸酶的制备方法，制得重组瓜氨酸酶可以水解瓜氨酸制备鸟氨酸。
(二)【背景技术】
[0002]鸟氨酸，分子式H2N(CH2)3CH(NH2) COOH，是一种碱性氨基酸，是非蛋白质氨基酸。鸟氨酸是人体代谢中必不可少的中间代谢产物，存在于人尿及动物肝脏中，是代谢循环中最早发现的与尿素循环有关的重要氨基酸。在生物体内，尿素循环具有重要的生理意义，对于体内氨态氮的排出有重要作用。氨对组织细胞具有毒性作用，如引起肌肉共济失调、过敏，对中枢神经系统的毒害作用等，大量堆积会对大脑产生巨大损伤。因此，解除氨的毒性对于维持正常生理机能具有重要的意义。正常人体解除氨毒性的方式主要通过在肝脏进行的尿素酸循环而完成。在尿素循环中，胺甲酰磷酸与鸟氨酸化合生成瓜氨酸和磷酸，瓜氨酸再转化为精氨酸，精氨酸再裂解为尿素和鸟氨酸，鸟氨酸进一步进入下一轮循环，因此尿素循环也叫鸟氨酸循环。鸟氨酸和瓜氨酸均为尿素循环中的主要氨基酸，通过尿素循环将人体蛋白质代谢产生的氨基酸、氨基酸产生的氨转化为尿素并排出体外而解毒，促进氮的正常代谢。
[0003]因此，鸟氨酸在临床上常用来进行相 除作为试剂与注射液外，通常与精氨酸一起用于配置恢复疲劳的发泡饮料。鸟氨酸虽然是非蛋白氨基酸，但存在于生物体多种组织和细胞中，对肝硬化以及无显著特点的感染、癌症、外伤和烧伤的恢复有很大帮助，被广泛用于制备保肝、护肝、治疗肝病、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液及抗疲劳的发泡饮料中。研究发现乌氨酸可剌激脑垂体分泌生长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢，增强肌肉和体力，起到减肥的作用。因此，它是抗衰老所需要的，它有助于维护肌肉和身体组织营养需求。鸟氨酸还能增加聚乙烯胶的合成，促进细胞增殖，有提高免疫功能和抗癌作用。鸟氨酸衍生物依氟鸟氨酸能抑制多胶合成，延缓肿瘤细胞生长，是新型抗癌药物。门冬氨酸鸟氨酸注射液用于治疗肝性脑病，机理可能与它们能够快速激活肝脏解毒功能中的关键酶，清除体内氨中毒，从而快速改善肝性脑病临床症状，显著提高患者神志清醒率并且极大缩短清醒时间。此外，鸟氨酸和精氨酸也是健美和肌肉营养补充品中的主要成分。鸟氨酸负责提高激素水平，人们需要它在体能训练中建立和保持肌肉。它有助于减少衰老过程中的肌肉损失。随着年龄的老化，人体合成蛋白质的效率会降低，肌肉组织再生能力也会降低。鸟氨酸通过提高生长激素水平，有助于加快肌肉组织生产，并延迟衰老的影响。
[0004]目前鸟氨酸主要生产方法有化学法、发酵法和酶法3种(张鹏等，2009)。化学法是利用弱碱水解精氨酸得到鸟氨酸和少量瓜氨酸。化学法生产鸟氨酸产物为DL-型外消旋体，分离困难，生产过程不易控制，现已被淘汰。发酵法主要是利用微生物发酵，如利用精氨酸或瓜氨酸的营养缺陷型突变株来积累鸟氨酸。发酵法原料成本低廉，但是发酵液中成分复杂，后续分离困难。酶法是利用生物体内的酶来水解精氨酸、瓜氨酸等生成鸟氨酸。该法转化率高，产品较纯，利于后续分离。目前报道的酶法制备鸟氨酸的方法中，只有精氨酸酶，即利用该酶水解精氨酸得到鸟氨酸，但精氨酸酶大都来自于动物的肝脏，成本较高。因此，有必要开发新酶来制备鸟氨酸。瓜氨酸水解也是制备鸟氨酸的重要途径，利用瓜氨酸酶水解瓜氨酸制备鸟氨酸尚未报道。 [0005]瓜氨酸(Citrulline)的化学式是H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)COOH，也是尿素循环的关键中间体。它是由Koga等于1914年首次从西瓜中分离到的，瓜氨酸通常存在于西瓜、植物种子等中，现代技术能够将其直接分离提纯得到。瓜氨酸不止存在于植物中，比如肉，鱼，乳，蛋等食物中也都有发现瓜氨酸的存在。瓜氨酸酶(citrulline ureidase, CTU,EC3.5.1.20)是一种能将瓜氨酸降解成鸟氨酸，CO2和氨的酶。Mahawar等(2009)已经证明土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)表现出高的CTU活性，CTU是由土拉弗朗西斯菌基因(FTT0435)编码的碳氮水解酶家族成员。土拉弗朗西斯菌是强致病菌，不适用进行科学研究和安全生产。
(三)
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种重组瓜氨酸酶的制备方法，为酶法制备鸟氨酸提供了基础。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]一种重组瓜氨酸酶的制备方法，所述方法包括:
[0009](I)化学合成序列如SEQ ID N0.1所示的CTU基因编码区DNA ；
[0010](2)合成的DNA在5'端引入Nco I位点、3'端引入Xho I位点，经过亚克隆化和测序确认后，用Nco I/Xho I双酶切目标基因和表达载体pET-22b，酶切产物经过割胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，获得阳性转化子，提取质粒进行酶切鉴定，获得重组质粒pET-22b-ctu ；
[0011](3)重组质粒pET-22b-ctu加入到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，混匀，冰浴30min，然后42°C水浴中热击1.5min后，迅速置于冰上2min，加入SOC培养基，再于37°C、200r/min摇床培养lh，取转化液涂布到含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，经PCR确认，挑选出阳性克隆；所述SOC培养基终浓度组成如下:胰化蛋白胨20g/L，酵母提取物 5g/L, NaCl0.5g/L, KC12.5mmol/L, MgCl20.01mmol/L，葡萄糖 3.6g/L, ρΗ7.0，溶剂为ddH20 ；
[0012](4)挑取阳性克隆单菌落至含100 μ g/mL Amp、山梨醇l%(w/v,质量体积百分比,浓度1%即IOOmL培养基中含有该组分Ig)的2XYT培养基中，37°C、200r/min培养至OD6tltl为0.5，加入0.5mM异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，20°C >200r/min摇床培养6h，收集菌体细胞，经分离纯化获得所述重组瓜氨酸酶；所述2X YT培养基终浓度组成如下:蛋白胨16g/L，酵母提取物 10g/L，NaC15g/L, pH7.0，溶剂为 ddH20。
[0013]所述分离纯化方法可如下:收集所得菌体细胞先用琼脂糖磁珠试剂盒进行细胞破碎，所得蛋白洗脱液进行梯度透析脱盐和复性，收集透析后蛋白液，即得所述重组瓜氨酸酶酶液。
[0014]具体梯度透析过程如下:将收集到的重组蛋白洗脱液小心的装入透析袋中，加上夹子，放入装有IL PBS缓冲液(含有250mM NaCl,500mM咪唑，pH7.0)的烧杯中，冰浴条件下磁力搅拌透析lh，然后换透析液IL PBS (含有125mM NaCl，250mM咪唑，ρΗ7.0)，继续冰浴磁力搅拌下透析lh，再换透析液IL PBS (含有62.5mM NaCl, 125mM咪唑，pH7.0)，继续冰浴磁力搅拌下透析lh，最后换透析液IL PBS(pH7.0)，透析过夜。收集透析后蛋白液，记录体积，测试蛋白浓度和活性，浓度过低的话使用超滤浓缩管进行浓缩。
[0015]本发明的有益效果主要体现在:本发明成功合成并克隆了瓜氨酸酶的基因，构建了大肠杆菌的重组表达载体，在大肠杆菌中表达和分离纯化了重组瓜氨酸酶CTU;纯化的重组CTU经过体外测定，具有活性，可以将瓜氨酸分解成为鸟氨酸，为酶法制备鸟氨酸增加了一条新途径。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1 为 pET-22b_ctu 双酶切结果； M:DNA ladder ；1:质粒 pET-22b_ctu 经 Nco I/Not I双酶切；
[0017]图2为培养基添加物对CTU表达的影响；M:蛋白质marker ；1:1%葡萄糖；2:l%NaCl ；3:1%甜菜碱；4:1%山梨醇；5:1%DTT ;箭头所示为CTU蛋白；
[0018]图3为培养基pH对CTU表达的影响；M:蛋白质marker ;1~5:重组CTU分别在pH为6.0,6.5,7.0,7.5,8.0下诱导表达；箭头所示即为CTU蛋白。
[0019]图4为为表达重组蛋白CTU的大肠杆菌;M:蛋白质marker ；1:菌体破碎后离心的上清液；2:菌体破碎、离心后沉淀的溶解液(包涵体溶解液)；3:培养基；
[0020]图5为薄层层析测定蛋白酶活；1:瓜氨酸标准样品；2:鸟氨酸标准样品；3:瓜氨酸在重组CTU催化后的反应液。
(五)【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0022]实施例1:
[0023]I表达载体的构建
[0024]根据Mahawar等(2009)报道的CTU基因(FTT0435)序列化学合成按照大肠杆菌密码子偏好性优化的编码区DNA。化学合成由南京金斯瑞生物公司完成。
[0025]CTU基因的序列如下:
[0026]ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGCTCGAGATGGCGAATATAAAAGTTGCAGTTGTCCAATTATCTTTTAATGATAATGAAGCTGAAAATTTAGCAAAACTGGAGAGTAAAATTATTCAAGCAGCTAAAAATGGTGCAAAAATAATTCTTACTCCAGAGTTACCAAGTTATCTATATTTTTGCAAAAAACAAAATTCTAAATATTTTGATTTAGCTAAAACCATTGATGAATCACCAATAGTAAAATTATATAAACTCTTAGCACATAAATATAATATTGTTTTGCCTGCTAGTTTTTTTGAGAGAGATGGAAATGCTTGTTATAACTCGATAGCAATGATTGATGCGGATGGTTCGATAATGGGTGTATATCGTAAAGCCCATATTCCAGACGGTATTGGTTACCAAGAGAAATATTATTTCTCACCTGGAAGTGCTGGTTTTAAGGTTTGGGATACTAAATATGCTAAAGTTGGAGTTGGTATTTGCTGGGATCAATGGTTTCCAGAAGCTGCTAGAGTAATGGCTTTAAAAGGTGCTGAAATTTTATTATATCCAACAGCAATAGGGAGCGAACCACACTTACCAGATTACGATTCAAAAGATCATTGGCAAAGAGTGATGCAAGGGCATGCTGCGGCAAATATGTTGCCCGTATTAGCATCAAATAGATATGCAACTGAGGCAAATGATGATATCACAGCAACTTATTAT
【权利要求】
1.重组瓜氨酸酶的制备方法，所述方法包括: (1)化学合成序列如SEQID N0.1所示的CTU基因编码区DNA ； (2)合成的DNA在5'端引入NcoI位点、3'端引入Xho I位点，经过亚克隆化和测序确认后，用Nco I/Xho I双酶切目标基因和表达载体pET-22b，酶切产物经过割胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，获得阳性转化子，提取质粒进行酶切鉴定，获得重组质粒pET-22b-ctu ； (3)重组质粒pET-22b-ctu加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，混匀，冰浴30min，然后42°C水浴中热击1.5min后，迅速置于冰上2min，加入SOC培养基，再于37°C、200r/min摇床培养lh，取转化液涂布到含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，经PCR确认，挑选出阳性克隆；所述SOC培养基终浓度组成如下:胰化蛋白胨20g/L，酵母提取物 5g/L, NaCl0.5g/L, KC12.5mmol/L, MgCl20.01mmol/L,葡萄糖 3.6g/L, ρΗ7.0，溶剂为ddH20 ； (4)挑取阳性克隆单菌落至含lOOyg/mLAmp、山梨醇1%的2 X YT培养基中，37 °C、200r/min培养至OD6tltl为0.5，加入0.5mM异丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷，20°C、200r/min摇床培养6h，收集菌体细胞，经分离纯化获得所述重组瓜氨酸酶；所述2 XYT培养基终浓度组成如下:蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaC15g/L, pH7.0，溶剂为ddH20。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述分离纯化方法如下:收集所得菌体细胞先用琼脂糖磁珠试剂盒进行细胞破碎，所得蛋白洗脱液进行梯度透析脱盐和复性，收集透析后蛋白液，即得所述重 组瓜氨酸酶酶液。
【文档编号】C12N15/70GK103571816SQ201310534080
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】朱廷恒, 方三余, 王渭霞, 汪琨, 崔志峰 申请人:浙江工业大学