一种大黄鱼原肌球蛋白基因及其重组蛋白与应用的制作方法
【专利摘要】一种大黄鱼原肌球蛋白基因及其重组蛋白与应用，涉及一种原肌球蛋白。蛋白基因具有NO.1基因序列，GST重组蛋白具有NO.2氨基酸序列，重组蛋白的制备：用2条特异性引物扩增原肌球蛋白基因的开放阅读框；插入表达载体pGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位点间；将构建好的重组表达载体pGEX-4T-2-Tropmyosin转入表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达；用Glutathione?Sepharose4B亲和层析纯化GST-Tropmyosin融合蛋白。可在制备提升大黄鱼抗病力药物中应用。
【专利说明】—种大黄鱼原肌球蛋白基因及其重组蛋白与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种原肌球蛋白(Tropmyosin),尤其是涉及一种大黄鱼原肌球蛋白基因及其重组蛋白与应用。【背景技术】
[0002]大黄鱼是我国海水网箱养殖量最大的鱼类，素有“海水国鱼”之称，年产量8万吨，年产值40多亿元。但是目前大黄鱼的养殖受到多种疾病的严重威胁,对于养殖大黄鱼病害的控制，目前主要依靠化学药物和抗生素，由此造成了病原菌抗药性增加、养殖产品中药物残留、环境污染和出口受阻等一系列问题。
[0003]原肌球蛋白(Tropmyosin)是1948年发现的一种骨架蛋白，是由α -螺旋结构和卷曲螺旋结构构成的纤维蛋白质[Smillie I B.Structure and functions of Tropmyosinsfrom muscle and nonmuscle sources[J].Trends Biochen Sc1.1979，4:151-155]。原肌球蛋白(TiOpmyosin)是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，它在细肌丝中与肌动蛋白(Actin)双螺旋并行存在，可影响并调控肌动球蛋白之间的相互作用，在细胞移动、形态发生和胞浆移动中调节肌动蛋白丝的动态变化[HSbig K，Gellhaar S, Heim
B,et al.LRRK2guides the actin cytoskeleton at growth cones together withARHGEF7and Tropmyosin4 [J].Biochim Biophys Acta.2013，4439 (13): 288-293]。原肌球蛋白(TiOpmyosin)家族序列高度保守，存在于肌肉和非肌肉细胞，也存在于多种器官和组织。大量研究发现，原肌球蛋白(TiOpmyosin)是引发食用鱼、虾、蟹后导致食物过敏的主要致敏原[Nakano S，Yoshinuma T, Yamada T.Reactivity of shrimp allergy relatedIgE antibodies to krill Tropmyosin[J].1ntArchAl lergylmmuno
1.2008, 145(3): 175-181]。在人类疾病研究方面,现已发现原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的突变与多种疾病特别是许多癌症的发生有关[Malfatti E, Schaeffer U, ChaponF，et al.Combined cap disease and nemaline myopathy in the same patient causedby an autosomal dominant mutation in the TR0PMY0SIN3gene[J].NeuromusculDisord.2013, 8966 (13): 546-554]。但是，至今尚未有大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)序列的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因。
[0005]本发明的第二目的在于提供大黄鱼原肌球蛋白基因的克隆方法。
[0006]本发明的第三目的在于提供大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白。
[0007]本发明的第四目的在于提供大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白的制备方法。
[0008]本发明的第五目的在于提供大黄鱼原肌球蛋白基因的应用。
[0009]所述大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因，具有序列表中SEQ ID N0.1基因序列。
[0010]所述大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的克隆方法,包括如下步骤:[0011]I)从大黄鱼的肌肉组织中提取总RNA ；
[0012]2)进行cDNA第一链合成；
[0013]3)根据其它鱼类Tropmyosin的保守序列设计引物进行PCR反应，得到原肌球蛋白(Tropmyosin)基因片段,其中:
[0014]正向引物Fl:5’ CCAGTTGGTKGAGGAGG3，；
[0015]反向引物Rl:5’ GffGTAGTCATRTCGTTG3?；
[0016]4)用2条基因特异性正向引物:
[0017]F2:5， CGCGCTCAGGAGAGACTG3，；
[0018]F3:5，GAAGGTGATCGAGAACAG3，；
[0019]进行原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA3’端快速扩增(3，RACE)；
[0020]5)用2条基因特异性反向引物:
[0021]R2:5， CTACAGAGTAGTCATGTC3，；
[0022]R3:5， TTCAGCTGCATCTCTTGG3?；
[0023]进行对原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA5’端快速扩增(5，RACE)。
[0024]所述大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)的GST重组蛋白，具有序列表中SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
[0025]所述大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白的制备方法，具体步骤如下:
[0026]I)用2条特异性引物:
[0027]正向引物F4:5，CGGAATTCATGGAGGCCATCAAGAAG3，(斜体表示 EcoRI 的酶切位点);
[0028]反向引物R4:5’CCGCTCGAGCTACAGAGTAGTCATGTC3，(斜体表示 XhoI 的酶切位点);扩增原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的开放阅读框；
[0029]2)插入表达载体PGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位点间；
[0030]3)将构建好的重组表达载体pGEX-4T-2-Tropmyosin转入表达菌株BL21 (DE3)进行IPTG诱导表达；
[0031]4)用 Glutathione Sepharose4B 亲和层析纯化 GST-Tropmyosin 融合蛋白。
[0032]所述大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因可在制备提升大黄鱼抗病力药物中应用。
[0033]本发明在大黄鱼疾病防治及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，并为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
[0034]本发明的有益效果为:本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3 ’端cDNA快速扩增(3 ’ -RACE)以及5 ’端cDNA快速扩增(5 ’ -RACE)的方法，对大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因全长cDNA进行了研究，首次从大黄鱼中克隆到了原肌球蛋白(Tropmyosin)基因全长cDNA序列，用于原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的重组表达、蛋白质纯化和功能研究。采用本发明中所述方法，能够从大黄鱼肌肉中克隆到I种原肌球蛋白(Tropmyosin)基因,采用本发明对大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的成功克隆和测序，首次得到了 I种大黄鱼的原肌球蛋白(TiOpmyosin)基因，搞清了它们的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列。通过网上相似性和同源性检索，提示大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)在大黄鱼免疫反应中起重要作用，在大黄鱼的病害防治中具有广泛的应用价值。采用本发明首次将该基因进行重组表达，得到了大黄鱼重组表达的原肌球蛋白(Tropmyosin)融合蛋白，环境友好,无污染。在大黄鱼疾病防治及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，在为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】 [0035]图1是本发明大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因在大肠杆菌诱导表达的重组蛋白及纯化电泳图。在图1中，M，蛋白质Marker ;1，非重组菌株未诱导；2，非重组菌株诱导；3，重组菌株未诱导；4，重组菌株诱导；5，纯化的融合蛋白。
【具体实施方式】
[0036]实施例1
[0037]本实施例的一种克隆的大黄鱼原肌球蛋白(Tropmyosin)基因，具有序列表中SEQID N0.1喊基序列ο
【权利要求】
1.大黄鱼原肌球蛋白基因，其特征在于具有序列表中SEQID N0.1基因序列。
2.如权利要求1所述大黄鱼原肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤: 1)从大黄鱼的肌肉组织中提取总RNA； 2)进行cDNA第一链合成； 3)根据其它鱼类Tropmyosin的保守序列设计引物进行PCR反应，得到原肌球蛋白(Tropmyosin)基因片段,其中:
正向引物 Fl:5，CCAGTTGGTKGAGGAGG3，； 反向引物 Rl:5，GffGTAGTCATRTCGTTG3?； 4)用2条基因特异性正向引物:
F2:5， CGCGCTCAGGAGAGACTG3，；
F3:5，GAAGGTGATCGAGAACAG3，； 进行原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA3’端快速扩增(3’ RACE)； 5)用2条基因特异性反向引物:
R2:5， CTACAGAGTAGTCATGTC3，；
R3:5， TTCAGCTGCATCTCTTGG3?； 进行对原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA5’端快速扩增(5’ RACE)。
3.大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白，其特征在于具有序列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述大黄鱼原肌球蛋白的GST重组蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤如下: 1)用2条特异性引物: 正向引物 F4:5’ CGGAATTCATGGAGGCCATCAAGAAG3，(斜体表示 EcoRI 的酶切位点); 反向引物R4:5’ CCGCTCGAGCTACAGAGTAGTCATGTC3’ (斜体表示XhoI的酶切位点);扩增原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的开放阅读框； 2)插入表达载体pGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位点间； 3)将构建好的重组表达载体pGEX-4T-2-Tropmyosin转入表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达； 4)用Glutathione Sepharose4B 亲和层析纯化 GST-Tropmyosin 融合蛋白。
5.如权利要求1所述大黄鱼原肌球蛋白基因在制备提升大黄鱼抗病力药物中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103555730SQ201310533906
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】韩芳, 王志勇 申请人:集美大学