两种细菌混合培养生产聚羟基脂肪酸酯的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用两株野生菌联合发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法，该方法是：细菌1175(芽孢杆菌属)和WN-H41(伯克氏菌属)分别接种到发酵培养基中。两株菌种子都培养18h。先接种1175，发酵培养24h；再补接WN-H41，继续发酵48h终止(总接种量为10％，1175／WN-H41=1／2)。在培养基未完全优化的情况下，聚羟基脂肪酸酯(PHA)的提取率在40％以上，乳白色。GPC检测Mn=1.12*105，PDI=1.16。该方法相比于纯菌发酵有一定的优势：底物的选择范围更大，无菌要求会降低，提高了产物多样性等。也为生物降解塑料的开发利用提供了一种思路。
【专利说明】两种细菌混合培养生产聚羟基脂肪酸酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用两株野生菌联合发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)-生物可降解塑料的方法。
【背景技术】
[0002]塑料已成为国民经济中的第四大支柱产业。随着需求的不断增强，传统塑料过度依赖化石燃料，使用后难回收、难降解的弊端日渐凸显。同时，新疆作为一个农业大省每年需要大量的农膜和节水管材，这些产品目前多为化学合成产品，如果能用生物可降解塑料部分或全部替代它们，将对以后的耕作和作物生长极为有利。这就要求科研工作者开发新型的绿色塑料。
[0003]聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物积累的储存性聚酯颗粒。是在不平衡生长条件下胞内能量和碳源的储藏物质，自然条件下可完全生物降解。有氧条件下，PHA能完全降解成水和C02。在厌氧条件下，PHA能被微生物降解生成甲烷。作为一种潜在的环境友好型可生物降解塑料，其具有与聚丙烯(PP)相似的性质，因此成为近年来研究的热点。
[0004]现阶段PHA合成发酵过程大多是利用纯种微生物、基因工程菌，生产原料主要是葡萄糖或者价格较昂贵的丙酸、戊酸等有机底物，高产菌株的寻找，底物的选择，设备的灭菌以及产物提纯都制约着PHA生产成本的降低。为了抵消高生产成本，应用领域还主要局限于医用器材，高档化妆品包装盒等高附加值产品。现在研究表明，利用多菌混合发酵生产PHA更有优势，不论是对经济方面还是环境方面。目前利用微生物混合发酵生产PHA的报道还较少，或单纯利用驯化的活性污泥进行发酵。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，这种方法可以丰富PHA的生产，降低无菌要求，使生产的PHA性能优越。
[0006]本发明是通过以下技术方案得以实现的:
[0007]通过实验，从新疆自然环境筛选出合成PHA的菌株，经形态观测及基因序列比对确定种属。
[0008]两种菌(WN-H4I和1175)混合发酵培养，优化发酵工艺。
[0009]分离提纯产物，对其结构进行分析，做分子量、热性能和力学性能的测定。混合发酵产物与纯菌发酵产物进行比较。
[0010]本发明的优点:目前生产PHA主要主要利用纯菌或重组菌。混合发酵也多限于驯化活性污泥。两种野生菌联合发酵产PHA的方法与纯菌/重组菌发酵相比，对杂菌的耐受性要强些，底物选择面广；与活性污泥发酵相比，目标菌种更明确，利于后续代谢研究。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，[0012]实施例1:两株菌混合发酵
[0013]都选择18h发酵的种子接种，发酵培养基为贫氮培养基。混合发酵先接种1175，发酵 24h 后接种 WN-H4I, (1175 / WN-H4I=I / 2，总接种量为 10% ), IOOmL / 250mL 锥形瓶，30°C, IOOr / min，总发酵时间 72h。
[0014]表1纯菌发酵与混合发酵的比较
[0015]
【权利要求】
1.一种利用两株野生菌联合发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)-生物可降解塑料的方法，其特征在于，选用两种明确的细菌1175(芽孢杆菌属)和WN-H4K伯克氏菌属)混合发酵生产聚羟基脂肪酸酯。
2.根据权利要求1所述的一种利用两株野生菌联合发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)-生物可降解塑料的方法，其特征在于，细菌1175和WN-H4I的接种方式为先接1175，24h 后接 WN-H4I。
3.根据权利要求1所述的一种利用两株野生菌联合发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)-生物可降解塑料的方法，其特征在于，细菌1175和WN-H4I的总接种量为10%，两株菌的接种比例(1175 / WN-H4I)是I / 2。
4.根据权利要求1所述的产物提纯方法，其特征在于，冻干细胞先超声萃取20min，再用甲醇-氯仿(V / v=l / 2)溶液40°C抽提12h。
5.根据权利要求1所述的产物提纯方法，其特征在于，抽提完毕用4层纱布过滤两遍，滤液用冷甲醇析出产物。
【文档编号】C12R1/22GK103627774SQ201310572845
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】鲁建江, 郑冰心, 童延斌, 李姗蔓, 陈倩倩 申请人:石河子大学