一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，属于生物制品【技术领域】，所述方法包括：1）种细胞的制备，2）生物反应器的准备，3）PK-15细胞悬浮培养，4）PK-15细胞悬浮培养病毒，5）细胞悬浮病毒培养及连续收获，6）病毒液培养周期及收获量。本发明逾越了转瓶生产工艺存在的多种技术瓶颈，提供了一种利用片状载体悬浮培养PK15细胞，获得高效、可持续性、大规模生产高滴度圆环病毒2型（PCV2）病毒液的工艺。
【专利说明】一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，属于生物制品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]圆环病毒病感染是近年来发现的一种比较难控制的传染病。该疾病主要侵害哺乳仔猪和育肥猪，及怀孕母猪。其特征性临床症状为患猪体质不良，皮肤苍白。引起的疫病包括猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，增生性坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾病综合征(TONS)、猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等。同时PCV-2感染产生的免疫抑制极易引发其它病原混合感染或继发感染。2006、2007年，猪圆环病毒在中国猪“无名高热症”发生中起着重要的诱因作用。目前，圆环病毒病在我国已普遍发生，表现为流行范围广、阳性率高、混合感染严重、种猪感染率高等特点，给我国养猪业造成严重的经济损失。由于本病的危害日益严重，已引起人们的密切关注，养猪行业人士更将其列为当前危害养猪业发展的头号疫病。疫苗免疫是预防该病发生的最有效方法之一。
[0003]使用生物反应器大规模培养细胞，获得高病毒含量抗原，是当前生物制品生产和疫苗行业发展的主流模式和 必然趋势。使用生物反应器比传统的转瓶培养工艺具有不可比拟的优势，比如:利于对污染和内毒素的控制，大幅度提高细胞密度和毒液抗原含量，抗原批间次差异小，培养基血清含量低，疫苗质量均一，疫苗注射反应小、免疫抗体水平高、整齐、免疫持续期长，减少对厂房面积的需求，减少对人力的依赖，可以实现远程监视与控制等常规细胞培养所不具备的多种技术优势。
[0004]目前，国内常规生产猪圆环病毒2型(PCV2)工艺主要是转瓶生产培养，产出的PCV2的病毒滴度均在105_°左右，利用生物反应器及片状载体生产工艺，可提高PCV2病毒产量和滴度，可以产出滴度高达106_5TCID5tZml以上的病毒液，病毒产量是传统转瓶工艺的100倍左右。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术的不足，提供一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，本发明逾越了转瓶生产工艺存在的多种技术瓶颈，提供了一种利用片状载体悬浮培养PK15细胞，获得高效、可持续性、大规模生产高滴度圆环病毒2型(PCV2)病毒液的工艺。
[0006]一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤:
[0007]I)使用转瓶培养制备密度为2~3X IO5个/mL的PK-15细胞液；
[0008]2)于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中:每接种IL的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4~5L ;
[0009]3)接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85~100转/分，溶氧为
40~50%，pH 为 7 ~7.2，温度为 36.8 ~37.3°C ；
[0010]4)所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型(PCV2)，病毒接种量为生物反应器培养基8% (V/V)，并同时加入终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90~100转/分，溶氧为50~55%，pH为7.2~7.4，温度为36.4~36.8 0C ； [0011]5)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4)相同，其中:所述步骤2)中每接种IL的所述细胞液，此步骤中灌注量为平均每天15L ；
[0012]6)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种后240~360小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒2型(PCV2)病毒液。
[0013]以5L工作体积为例，本发明一个PK-15细胞悬浮培养猪圆环病毒2型(PCV2)周期为13天,共收获病毒液量约150L左右。
[0014]其中，所述生物反应器可选用美国NBS公司生产的7.5L生物反应器，所述片状载体可选用美国NBS的Fibra-Cel Disks。
[0015]优选的，所述的步骤3)中培养条件为:搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为
7.2，温度为37。。。
[0016]优选的，所述的步骤4)中的培养条件为:搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为
7.4，温度为 36.50C ο
[0017]优选的，所述的步骤5)中的培养基中牛血清的质量百分含量为1%。
[0018]更优选的，所述的步骤6)中病毒培养收获时间为病毒接种后240小时。
[0019]与现有的生产工艺相比，本研究是通过新型的生物反应器及片状载体进行高效地培养高密度细胞以及高滴度的PCV2病毒液，从而为生产高质量的PCV2疫苗奠定基础。
[0020]本发明具有以下优点:
[0021]1.有效降低劳动强度:以7.5L生物反应器为例，该生物反应器的工作体积为5L，载体装量为250g，载体表面所提供的细胞贴壁的面积与80个15L转瓶相当，从而可有效减少常规生产工艺中转瓶培养所需要的劳动强度。
[0022]2.操作简便、培养参数可控制:本发明所涉及的生产工艺仅需I个人就可以完成，可实现病毒繁殖的机械化、自动化、精确化培养，每批次病毒滴度稳定，批间次各项技术指标差异小，更易实现病毒生产的标准化管理。而传统工艺则需要80个15L的转瓶或至少5人才能完成，基本手工操作完成，人为及不确定因素影响较大即生产的病毒液质量随PK-15细胞生长状况不同，出现较大差异。
[0023]3.提高病毒产量与滴度:与传统生产工艺相比，该方法可以很大程度上扩大生产规模，以5L工作体积为例,本发明一个培养周期可以生产150L的病毒液,而传统工艺仅能生产约50L。传统生产工艺产出的PCV2的滴度仅为105_°TCID5Q/ml左右，而本发明使用的生物反应器及片状载体生产工艺可以产出滴度高达106_ 5TCID5ciAil的病毒液，即PK-15细胞悬浮培养工艺培养病毒，一个培养周期病毒产量是传统工艺的100左右。[0024]4.生产成本降低:传统的生产工艺中所使用的培养基中血清的浓度均较高，细胞扩繁需10%血清，病毒繁殖扩增需2%血清，而本发明中细胞吸附于片状载体及扩繁需5%血清，接毒后所维持液中血清含量仅为1%，与传统生产工艺相比大大降低生产成本。
[0025]5.生产空间小、密闭、不易造成生产和环境的双重污染:同等病毒抗原产量，悬浮培养工艺生产线空间是传统转瓶生产线的1/5 ;细胞悬浮培养生产病毒是在密闭容器中进行，不易引发外界环境或人为操作不当造成的产品污染及对环境的生物安全隐患。
【具体实施方式】
[0026]以下为对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0027]实施例1
[0028]一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，PK-15细胞培养圆环病毒生物反应器培养工艺研究该方法具体有以下步骤组成:
[0029]1 材料
[0030]1.1细胞PK-15细胞(无PCV-1污染)由扬州优邦生物制药有限公司扩繁并保存。
[0031]1.2毒种PCV-2 (YZ株)F15代由扬州优邦生物制药有限公司扩繁并保存。
[0032]1.3培养基及试剂DMEM购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；D_氨基葡萄糖购自BBI公司；PCV-2阳性血清购自VMRD公司；羊抗猪荧光二抗购自SouthernBiotech公司；其它试剂均为国产分析纯级。
[0033]1.4仪器7.5L生物反应器及配套片状载体购自NBS公司；倒置荧光显微镜购自Nikon公司；细胞转瓶机购自兰飞公司。
[0034]2 方法
[0035]2.1生物反应器的准备
[0036]7.5升反应器的工作体积为5升，载体使用量为250g/罐/次，载体表面积为1200cm2/g，相当于80个15升转瓶的培养面积。校正各电极，高压灭菌并进行无菌试验，无菌试验合格后即可进行细胞悬浮培养。
[0037]2.2种细胞的准备
[0038]将生长良好的单层PK-15细胞用0.25%胰酶-EDTA消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释至1.5 X IO5个/mL，接入1.5升转瓶中，每瓶800mL，置37°C温室培养48小时，挑选形态良好，折光率高，已形成良好单层的细胞作为接种反应器的种细胞。
[0039]2.3PK-15细胞悬浮培养
[0040]将IL含有2X IO5个/ml左右的PK-15细胞接入到反应器中，补充含5%牛血清的DMEM培养基至5L，设定搅拌转速为90转/分，溶氧50%，pH7.2，温度37°C，进行细胞悬浮培养。24小时后开启进液泵和出液泵进行流加培养至72小时。每天定时取样检测葡萄糖的消耗量并记录碱液(l%NaOH)的消耗量。
[0041]2.4PK-15细胞灌注式悬浮培养猪圆环病毒2型(PCV2) YZ株
[0042]反应器培养PK-15细胞至72小时，接入8%生物反应器培养基量的圆环病毒(YZ株)种毒(即400mL)，病毒维持液中含D-氨基葡萄糖浓度为2mmol/L。设定反应器搅拌转速为90转/分，溶氧50%，PH7.4，温度36.5°C，培养至24小时开始收获毒液并同时补充含1%血清的维持液，每日取样检测葡萄糖含量同时记录碱液(l%NaOH)的消耗量。
[0043]2.5病毒液收获及毒价测定
[0044]接毒后240小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒液。一个PK-15细胞悬浮培养猪圆环病毒2型(PCV2)周期为13天，平均每天收获病毒15L，共收获病毒液量约150L左右。收获病毒液10倍递增稀释，取10_6、10_7、10_8三个稀释度，用间接免疫荧光法检测TCID50,病毒液毒价平均值 为106.72TCID50/ml。
[0045]以上所述仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤: O使用转瓶培养制备密度为2~3X IO5个/mL的PK-15细胞液； 2)于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中:每接种IL的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4~5L ; 3)接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85~100转/分，溶氧为40~50%, pH 为 7 ~7.2，温度为 36.8 ~37.3°C ; 4)所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型(PCV2)，病毒接种量为生物反应器培养基8% (V/V)，并同时加入终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90~100转/分，溶氧为50~55%，pH为7.2~7.4，温度为36.4~36.8V ； 5)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4)相同，其中:所述步骤2)中每接种IL的所述细胞液，每天加流灌注量为15L ； 6)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种后240~360小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒2型(PCV2)病毒液。
2.根据权利要求1所述的一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，其特征在于:所述的 步骤3)中培养条件为:搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.2，温度为37。。。
3.根据权利要求1所述的一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，其特征在于:所述的步骤4)中的培养条件为:搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，PH 为 7.4，温度为 36.50C ο
4.根据权利要求1所述的一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，其特征在于:所述的步骤5)中的培养基中牛血清的质量百分含量为1%。
5.根据权利要求1至4任一所述的一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，其特征在于:所述的步骤6)中病毒培养收获时间为病毒接种后240小时。
【文档编号】C12R1/93GK103614344SQ201310616032
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】钱钟, 潘杰, 宋庆庆, 李群, 徐萍 申请人:扬州优邦生物制药有限公司