一种用于b细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于B细胞非霍奇金淋巴瘤耐药和疾病进展辅助诊断领域的一种用于B细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物。所述标志物为采用实时定量PCR的扩增产物，其序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明通过标志物检测其表达水平与疾病进展之间的相关性，I/II期、III/IV期B-NHL患者RIP2基因表达水平均显著高于正常对照组,III/IV期B-NHL组RIP2基因的表达水平显著高于I/II期组。耐药B-NHL组RIP2基因表达强度显著高于非耐药B-NHL组。表明RIP2mRNA表达水平与疾病进展呈显著正相关性。本发明采用实时定量PCR的方法能够精确、快速检测RIP2基因的表达水平。
【专利说明】—种用于B细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物
【技术领域】
[0001]本发明属于B细胞非霍奇金淋巴瘤耐药和疾病进展辅助诊断领域，具体涉及一种用于B细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物。
【背景技术】
[0002]淋巴瘤是起源于淋巴结或淋巴组织的恶性肿瘤，按病理和临床特点可分为霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma, HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin，s lymphoma, NHL)两大类。NHL是目前发病率增长速度最快的恶性肿瘤，在世界恶性肿瘤发病率排名中，分别占男性和女性恶性肿瘤的第8位和第11位(Chiappella A, Vitolo U.Highlights inlymphoma:overview of thellth International Conference on Malignant Lymphoma.Histopathology，2009，54(2):221-232.XNHL按细胞起源可分为B细胞性、T细胞性和NK细胞性三大类，B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是常见的来源于B淋巴细胞的恶性肿瘤，约占NHL 的 83%(Yian G, Roy E.S, Alan A.A，Karen L.K, Mengling L，Sherif I, Anna E.L, AnneZ.Circulating cytokines and risk of B—cell non-Hodgkin lymphoma:a prospectivestudy.Cancer Causes Control,2010，21:1323 - 1333.)。
[0003]90 %以上B-NHL细胞表达⑶20抗原，⑶20不易发生脱失、修饰和内化，因此是抗体介导的 B-NHL 治疗的理想革E 点(van Meerten T，Hagenbeek A.CD20_targetedtherapy: a breakthrough in the treatment of non-Hodgkin ^ s lymphoma.Neth J Med.2009Jul-Aug;67 (7):251-9。McLaughlin P,Gri1lo-Lopez AJ,LinkBK,Levy R,Czuczman MS，Williams ME,Heyman MR，Bence-Bruckler I,WhiteCA，Cabanillas F，Jain V，Ho AD，Lister J, Wey K，Shen D,Dallaire BK.Rituximabchimeric anti_CD20monoclonal antibody therapy for relapsed indolentlymphoma:half of patients respond to a four-dose treatment program.J ClinOncol.1998Aug;16(8): 2825-33。)。利妥昔单抗(rituximab)是人 / 鼠嵌合的抗 CD20 单克隆抗体，是目前CD20阳性B-NHL患者治疗的一线用药，对于低度恶性的B-NHL，利妥昔单抗单独治疗虽然能缓和病情，但对治疗侵袭性B-NHL的疗效不显著，约30%-40%的患者在治疗后复发出现治疗抵抗，导致治疗失败。而有一些患者在最初治疗就存在耐药性。因此发现B-NHL耐药和疾病进展的标志物以探索新的治疗方案提高利妥昔单抗治疗疗效是十分必要的。
[0004]目前B-NHL发生、发展及肿瘤细胞的耐药机制尚不明确。研究表明，B-NHL细胞耐药的主要原因是NF-kB信号通路高度活化，引起下游Bcl-2、Bcl-xL和MC1-1等抗凋亡蛋白过表达，从而促进瘤细胞存活(Pham LV，Fu L, Tamayo AT, Bueso-RamosC，Drakos E, Vega F，Medeiros LJ，Ford RJ.Constitutive BR3receptor signaling indiffuse, large B—cell lymphomas stabilizes nuclear factor-κ B-1nducing kinasewhile activating both canonical and alternative nuclear factor-κ B pathways.Blood.2011，6; 117 ⑴:200-10.)?受体相互作用蛋白 2(Receptor-1nteracting protein2,RIP2)具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，属于RIP家族成员。研究显示，RIP2在人组织中表达广泛，并且对其在多种细胞株中的表达分析发现，RIP2在B-NHL细胞株Raji细胞中呈现高表达，提示RIP2可能对B-NHL细胞生存起到重要作用。近期我们研究证实RIP2与TRAF3具有特异性相互作用，并通过RNAi干涉实验揭示RIP2在BAFF诱导的非经典NF- κ Β通路激活中作为正调控子发挥作用(Cai X, Du J, Liu Y, Xia ff, Liu J, Zou M, Wang Y, Wang M, Su
H,Xu D.1dentification and characterization of receptor-1nteracting protein2asa TNFR-associated factor3binding partner.Gene.517 (2): 205-11，2013.)。因此 RIP2对非经典NF- κ B通路的正调控作用可能是引起B-NHL抗凋亡的重要分子机制之一。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用于Β细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物。
[0006]一种用于Β细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物，所述标志物为采用实时定量PCR的扩增产物，其序列如SEQ ID N0.1所示，长度为127bp ;扩增引物为针对RIP2基因序列的特异性引物，RIP2基因序列的Genbank登录号为NM_003821 ;扩增模板为B-NHL患者外周血淋巴细胞中提取总RNA并反转录成的cDNA。
[0007]所述特异性引物为针对实时定量PCR的特异性引物；所述针对实时定量PCR的特异性引物为:引物fl为SEQ ID N0.2所示核苷酸序列，引物rl为SEQ ID N0.3所示核苷酸序列。
[0008]本发明的有益效果:本发明通过标志物检测其表达水平与疾病进展之间的相关性，按临床分期分组结果显示，Ι/II期、III/IV期B-NHL患者RIP2基因表达水平均显著高于正常对照组，III /IV期B-NHL组RIP2基因的表达水平显著高于I / II期组，具有显著性差异。按耐药与否分组结果显示，耐药组B-NHL患者外周血淋巴细胞中RIP2基因表达水平，与正常对照组相比，其表达水平明显升高，具有显著性差异。表明RIP2mRNA表达水平与疾病进展之间的密切程度高，呈显著正相关性。本发明采用实时定量PCR的方法能够精确、快速检测RIP2基因的表达水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为实时定量PCR检测RIP2在B-NHL病例组与正常组表达水平；*:P<0.05，与正常对照组比较。
[0010]图2为real time q_PCR扩增目的基因的溶解曲线图；A为real time q_PCR扩增PBMC RIP2的溶解曲线；B为:real time q-PCR扩增PBMC GAPDH的溶解曲线。
[0011]图3为B-NHL按临床分期分组PBMC RIP2表达水平的柱形图；*:P<0.05，与正常对照组比较；Λ:Ρ<0.05，与I / II期组比较。
[0012]图4为B-NHL按耐药与否分组PBMC RIP2表达水平的柱形图；*:P<0.05，与正常对照组比较；Λ:Ρ<0.05，与非耐药组比较。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。[0014]实施例1:B_NHL病例及对照的选择
[0015]2010年11月至2011年11月，军事医学科学院附属医院收治的36例经临床和病理确诊的B-NHL患者(B1~B27，B29~B38)，男性21例，女性15例，年龄8~74岁，平均年龄44.5岁，中位年龄45岁。按淋巴组织肿瘤WHO (2000)分型，弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselarge B cell lymphoma, DLBCL) 34 例，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL) 2 例。淋巴瘤国际预后指数(lymphoma international prognostic index, IPI)评分 0 ~2 分 18例，3~4分18例。按Ann Arbor分期标准，I / II期7例，III / IV期29例。36例B-NHL患者，均经4周期以上R_CH0P为主方案化疗，全面复查CT等影像学检查评价疗效，完全缓解(CR)或部分缓解(PR)判断为非耐药；如疗效为疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)，再予DICE、ProMACE/CytoBOM、吉西他滨等二、三线方案化疗、局部放疗等，仍不能有效控制病情者判断为耐药。9例为耐药患者，27例为非耐药患者。另将同期7名健康献血员作为对照组，男性4例，女性3例，年龄23~48岁，平均年龄31岁，中位年龄33岁。
[0016]实施例2:提取RNA
[0017]抽取研究对象静脉血3ml，EDTA抗凝用以提取RNA。RNA的提取方法，具体见盖宁生物科技有限公司生产的超纯总RNA快速提取试剂盒说明书。每份血样提取RNA后都分别对提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，利用紫外分光光度仪检测其浓度。计算3微克所需反转录用量。
[0018]实施例3:引物设计
[0019]在GeneBank中下载登录的RIP2基因的mRNA序列。根据已报道的RIP2基因序列，运用生物信息学分析，选择针对实时定量PCR的靶序列(核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.1所示)，设计并合成针对实时定量PCR检测RIP2序列的特异性引物，上游引物:fl:5’-GTTGGGACAGCACCATTTCT-3’ (SEQ ID N0.2)下游引物:rl: 5’-ATACCAGGCTGCAGACGTTC_3’ (SEQ ID N0.3)。上下游引物间的RIP2片段长127bp。将hGAPDH磷酸甘油醛脱氢酶设为内参照物，上下游引物间的hGAPDH片段长87bp`。`上游引物
[0020]f2:5’ -TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’ 下游引物:r2:
[0021]5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。对 RIP2 基因预期产物进行 BLAST 分析。结果证实所设计的目的片段与RIP2基因的同源率为100%，而与其它因子的同源率均小于40%。
[0022]实施例4:实时定量PCR检测RIP2基因的表达:
[0023]首先采用RT-PCR方法:以提取的RNA为模板，模板浓度为3 μ g，反应体系如下:
[0024]
【权利要求】
1.一种用于B细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物，其特征在于，所述标志物为采用实时定量PCR的扩增产物，其序列如SEQ ID N0.1所示，长度为127bp ;扩增引物为针对RIP2基因序列的特异性引物，RIP2基因序列的Genbank登录号为NM_003821 ;扩增模板为B-NHL患者外周血淋巴细胞中提取总RNA并反转录成的cDNA。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述特异性引物为针对实时定量PCR的特异性引物；所述针对实时定量PCR的特异性引物为:引物fl为SEQ ID N0.2所示核苷酸序列，引物Π为SEQ ID N0.3所示核`苷酸序列。
【文档编号】C12N15/11GK103667466SQ201310631765
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】徐东刚, 蔡欣, 苏航, 王园园, 邹民吉, 付文亮, 刘静 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所