来源于水稻的蛋白质OsMKK4及其相关生物材料在调控植物穂型中的应用的制作方法

来源于水稻的蛋白质OsMKK4及其相关生物材料在调控植物穂型中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了来源于水稻的蛋白质OsMKK4及其相关生物材料在调控植物穂型中的应用。其中的一种应用是培育直立穗型转基因水稻的方法。该方法包括向受体水稻中导入OsMKK4的反义基因得到直立穗型转基因水稻的步骤；所述受体水稻为弯曲穂型水稻；所述OsMKK4是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物穂型相关的由a）衍生的蛋白质OsMKK4或与OsMKK4相关的生物材料可用于调控植物穂型，特别是水稻穂型。
【专利说明】来源于水稻的蛋白质0sMKK4及其相关生物材料在调控植物穂型中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及来源于水稻的蛋白质0sMKK4及其相关生物材料在调控植物穂型中的应用。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上重要的粮食作物之一。随着耕地面积的减少和人口的快速增长，提高水稻产量对保证我国粮食安全具有十分重要的意义。通过改良植物株型可以有效的提高作物的粮食产量。历史上株型的改良在水稻品种改良中发挥了巨大作用。如第一次绿色革命，即水稻的矮化育种，大幅度提高了水稻抗倒伏能力，使水稻单产水平有了第一次飞跃。除株高以外，叶型以及穗型等属于水稻株型的指标，且水稻产量直接由穗型决定。直立穗相对于弯曲穗有许多优点，可以减少穗部对中下部的遮光，有利于光合作用，同时可以提高抗倒伏性，增加群体中co2的扩散效率，进而提高水稻群体的光合速率，增加产量。
[0003]0sMKK4属于MAPK信号转导通路的一个重要组成部分。MAPK级联信号转导系统在酵母、动植物等生物中高度保守，参与细胞分裂、发育以及对外界环境的响应活动。

【发明内容】

[0004]本发明所要解决的技术问题是提供来源于水稻的蛋白质0sMKK4及其相关生物材料的新用途。
[0005]本发明所提供的一种新用途是0sMKK4或与0sMKK4相关的生物材料在调控植物穂型中的应用；
[0006]所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白质:
[0007]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008]b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物穂型相关的由a)衍生的蛋白质；
[0009]所述与0sMKK4相关的生物材料，为下述B1)至B10)中的任一种:
[0010]B1)降低所述0sMKK4表达的核酸分子；
[0011]B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0012]B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0013]B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0014]B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0015]B6)编码所述0sMKK4的核酸分子；
[0016]B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒；
[0017]B8)含有B6)所述核酸分子的重组载体、或含有B7)所述表达盒的重组载体；[0018]B9)含有B6)所述核酸分子的重组微生物、或含有B7)所述表达盒的重组微生物、或含有B8)所述重组载体的重组微生物；
[0019]B10)含有B6)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B7)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B8)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0020]其中，序列表中序列2由369个氨基酸残基组成。
[0021]上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0022]上文中，降低所述0sMKK4表达的核酸分子可为所述0sMKK4的反义基因，编码所述0sMKK4的核酸分子可为所述0sMKK4的编码基因，所述0sMKK4的编码基因是如下1)、2)或3): [0023]1)其编码序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；
[0024]2)在严格条件下与1)限定的cDNA分子杂交且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA ；
[0025]3)与1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA。
[0026]其中，序列表中序列1由1110个核苷酸组成。
[0027]在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反义基因与所述0sMKK4的编码基因反向互补。
[0028]上述应用中，所述植物可为水稻。
[0029]含有所述核酸分子的表达盒均可含有所述核酸分子和启动所述核酸分子转录的启动子。含有所述核酸分子的表达盒不但可包括启动所述核酸分子转录的启动子，还可包括终止所述核酸分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于:花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(〃LAP〃，Chao等人(1999)Plant Physioll20:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1 (PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267);四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128 (CN101063139B(中国专利200710099169.7)),种子忙存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆 beta conglycin 的启动子(Beachy 等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如:Odell 等人(1985)Nature313:810 ；Rosenberg 等人(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mo 1.Gen.Genet, 262:141; Proudfoot (1991) Cell, 64:671; Sanfacon等人 Genes Dev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989) Nucleic Acids Res.17:7891 ； Joshi 等人(1987) NucleicAcid Res., 15:9627)。
[0030]可用现有的植物表达载体构建含有所述表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如PGWB412、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。在本发明的一个【具体实施方式】中，B3)所述的重组载体为0sMKK4的反义基因表达载体pIPKb003-AS0sMKK4o
[0031]上文中，所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产喊菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述转基因植物细胞系为非植物繁殖材料。
[0032]本发明所提供的另一个用途是培育直立穗型转基因水稻的方法。
[0033]本发明所提供的培育直立穗型转基因水稻的方法，包括向受体水稻中导入0sMKK4的反义基因得到直立穗型转基因水稻的步骤；所述受体水稻为弯曲穂型水稻；所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白质:
[0034]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0035]b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物穂型相关的由a)衍生的蛋白质。
[0036]在本发明的一个实施方式中，所述受体水稻的品种为兰胜。
[0037]上述方法中，在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反义基因与所述0sMKK4的编码基因反向互补。
[0038]所述0sMKK4的编码基因可是如下1)、2)或3):
[0039]1)其编码序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；
[0040]2)在严格条件下与1)限定的cDNA分子杂交且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA ；
[0041]3)与1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA。
[0042]上述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaP04和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5MNaP04和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，1 X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5M NaP04 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC，0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5M NaP04和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，0.1 XSSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5M NaP04和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0.1XSSC，0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 1 X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0043]上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0044]上述方法中，其中0sMKK4的反义基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果:
[0045]1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明0sMKK4的反义基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ；
[0046]2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
[0047]3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植`物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0048]4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
[0049]5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0050]上述方法中，0sMKK4的反义基因通过含有0sMKK4的反义基因的重组表达载体导入所述受体植物中。
[0051]所述0sMKK4的反义基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998, Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp.411-463;Geiserson andCorey,1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0052]上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物及其无性系，也包括其子代及其无性系。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0053]本发明的实验证明，向弯曲穂型的水稻中导入所述0sMKK4的反义基因得到的转基因水稻为直立穗型水稻，说明0sMKK4或与0sMKK4相关的生物材料可用于调控植物穂型，特别是水稻穂型。
[0054]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】

【附图说明】
[0055]图1为T0代转0sMKK4的反义基因植株的PCR鉴定图谱。
[0056]图2为T0代转0sMKK4的反义基因植株和作为转基因受体的水稻品种兰胜的照片。
【具体实施方式】
[0057]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0058]下述实施例中的pIPKb003 (Himmelbach A., Zierold U., Hensel G., RiechenJ.,Douchkov D., Schweizer P., Kumlehn J.(2007).A set of modular binary vectorsfor transformation of cereals.Plant Physiol.145:1192 - 1200),公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0059]下述实施例中的水稻品种兰胜(胡江，曾大力，张光恒，郭龙彪，董国军，高振宇，胡兴明，朱丽，刘坚，钱前。水稻矮化突变体的遗传分析和分子定位。中国水稻科学，2009，23(3):252-256)由中国水稻研究所提供，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0060]根癌农杆菌GV3101 (Li, Y., Zheng, L., Corke, F., Smith, C., and Bevan, M.ff.(2008).Control of final seed and organ size by the DAlgene family inArabidopsis thaliana.Genes Dev22, 1331-1336)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0061]实施例1、培育直立穂型的转基因水稻
[0062]1、0sMKK4编码基因的获得
[0063]1.1、提取尺熟
[0064]液氮研碎水稻日本晴的幼穗，用天根的植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)，提取总RNA。将得到的总RNA用分光光度计(Eppendorf公司，德国)检测样品中总RNA的浓度。
[0065]1.2、0sMKK4的反义基因的获得
[0066]根据RAP-DB (http://rapdb.dna.affrc.g0.jp/)上的 0sMKK4 基因序列设ii 对引物如下:
[0067]0sMKK4-S:5，-ATGCGACCGGGCGGGCCG ；
[0068]0sMKK4-A:5’ -TCATGACGGAGGCGGTGCGAG。
[0069]取5μ g总RNA,用反转录试剂盒(Invitrogen)进行反转录，以反转录得到的cDNA为模板，用引物对0SMKK4-S和0SMKK4-A进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为lllObp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pCR8/GW-T0P0 (Invitrogen)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据PCR8/GW-T0P0载体上的壮观霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的M13F(-20)和M13R为引物对其进行核苷酸序列测定，将测序结果表明含有0sMKK4的反义基因的重组质粒命名为T0P0-AS0sMKK4。
[0070]T0P0-AS0sMKK4含有的0sMKK4的反义基因的核苷酸序列与序列表中序列1的第1-1110位核苷酸反向互补。在核苷酸序列上，0SMKK4的反义基因与0SMKK4的编码基因反向互补，序列表中序列1的第1-1110位核苷酸编码序列表中序列2的蛋白质0sMKK4。
[0071]2、0sMKK4的反义基因表达载体的构建
[0072]Nhel酶切质粒T0P0_AS0sMKK4，回收3661bp的含0sMKK4的反义基因的大片段，将其与质粒pIPKb003进行LR重组反应(Invitrogen),参照Cohen等的方法(Proc NatlAcad Sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据pIPKb003载体上的壮观霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有0sMKK4的反义基因的重组质粒，命名为pIPKb003-AS0sMKK4o
[0073]将pIPKb003-AS0sMKK4 导入根癌农杆菌 GV3101，得到含有 pIPKb003_AS0sMKK4 的重组根癌农杆菌菌株，将该菌株命名为GV310l-AS0sMKK4。
[0074]3、转基因植株的获得
[0075]用GV3101_AS0sMKK4转化水稻品种兰胜，以获得转0sMKK4的反义基因植株。具体操作如下:
[0076]3.1.水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养:去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡l-2min,然后用0.1%升萊浸泡lOmin,进行表面灭菌，无菌水冲洗3_4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26°C暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。
[0077]3.2.农杆菌的培养
[0078]将GV3101-AS0sMKK4在含有50mg/L壮观霉素的LB平板上划线，28°C黑暗培养3天，用一金属匙收集农杆菌菌体，将其悬浮于共培养CM液体培养基中，调整菌体浓度至0D600为0.3-0.5，加入乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为100mM，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
[0079]3.3.水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
[0080]挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26 °C黑暗培养2-3天。
[0081]3.4.抗性愈伤组织的筛选
[0082]将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26°C暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
[0083]3.5.抗性愈伤组织的分化
[0084]从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15-25天左右，有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。
[0085]3.6.生根、壮苗和移栽
[0086]当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，移栽至田间，得到10株T0代转0sMKK4的反义基因植株，编号为 AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10。
[0087]其中，所用的培养基配方如下:
[0088]诱导培养基:N6大量元素+MS_Fe盐+B5微量元素+B5有机+2，4_D2.5mg/L+proline500mg/l+glutamine500mg/l+CH300mg/l+麦芽糖 / 鹿糖 30g/l+Gelrite2.6mg/l,ρΗ5.8ο
[0089]继代培养基:同诱导培养基，但是2，4-D改为2.0mg/L。
[0090]共培养(固体)培养基:N6大量元素+MS-Fe盐+B5微量元素+B5有机+2，4_D2.0mg/L+CH500mg/l+肌醇 2000mg/L+AS100yM+麦芽糖 /蔗糖 30g/l+Gelrite2.6mg/l,pH5.5。(液体选择培养基无Gelrite)。
[0091 ] 筛选培养基:N6大量元素+MS-Fe盐+B5微量元素+B5有机+2，4_D2.0mg/L+proline500mg/l+glutamine500mg/l+CH300mg/l+ 麦芽糖 / 鹿糖 30g/l+Gelrite2.6mg/l+cef250mg/l+Hyg50mg/l, pH5.8。
`[0092]分化培养基:N6大量元素+MS-Fe盐+B5微量元素+B5有机+NAA0.lmg/L+KT4mg/L+proline500mg/l+glutamine500mg/l+CH300mg/l+ 麦芽糖 / 鹿糖 30g/l+Gelrite2.6mg/1+cef.250mg/l+Hyg50mg/1, pH5.8。
[0093]生根培养基:1/2N6大量元素+MS_Fe盐+B5微量元素+蔗糖30g/l+Agar0.8%，pH5.8。
[0094]3.7、转0sMKK4的反义基因植株的鉴定
[0095]将3.6得到的10株TO代转0sMKK4的反义基因植株(编号为AS_1、AS_2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10 )通过PCR来进一步鉴定。以新鲜的转基因植株叶片的基因组DNA为模板，用引物对K4AS-F/K4AS-R进行PCR扩增。引物如下:
[0096]K4AS-F:aagaggggaaaagggcacta,
[0097]K4AS-R:agtccgcaaaaatcaccagt。
[0098]检测结果如图1所示。10株T0代转0sMKK4的反义基因植株均可以扩增出大小为1945bp的条带，作为转基因受体的水稻品种兰胜因为没有载体pIPKb003的序列，不能扩增出条带。图1中，泳道1-10为1'0代转(^1?4的反义基因植株45-1、45-2、45-3、45-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS_8、AS_9、AS-10，泳道11为作为转基因受体的水稻品种兰胜，泳道12为 pIPKb003-AS0sMKK4。
[0099]4、表型鉴定
[0100]将3.6得到的10株T0代转0sMKK4的反义基因植株(编号为AS_1、AS_2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10)和10株作为转基因受体的水稻品种兰胜在田间自然条件下生长，成熟时观察穗部表型并拍照记录，结果表明10株T0代转0SMKK4的反义基因植株(编号为 AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7、AS-8、AS-9、AS-10)在田间均为直立穗型(直立密穗)，而10株作为转基因受体的水稻品种兰胜在田间均为弯曲穗型(图2)。
[0101]图2中A是作为转基因受体的水稻品种兰胜(野生型)，B为T0代转0sMKK4的反义基因植株，C中左边是作为转基因受体的水稻品种兰胜(野生型)的穗部，右边为T0代转0sMKK4的反义 基因植株的穗部。A, B中标尺为10cm，C中标尺为5cm。
【权利要求】
1.培育直立穗型转基因水稻的方法，包括向受体水稻中导入0SMKK4的反义基因得到直立穗型转基因水稻的步骤；所述受体水稻为弯曲穂型水稻；所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白质:a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物穂型相关的由a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反义基因与所述0sMKK4的编码基因反向互补。
3.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述0sMKK4的编码基因是如下1)、2)或 3):1)其编码序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；2)在严格条件下与1)限定的cDNA分子杂交且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA ；3)与1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA。
4.0sMKK4或与0sMKK4相关的生物材料在调控植物穂型中的应用；所述0sMKK4是如下a)或b)的蛋白质:a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物穂型相关的由a)衍生的蛋白质；所述与0sMKK4相关的生物材料，为下述B1)至B10)中的任一种:B1)降低所述0sMKK4表达的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B6)编码所述0sMKK4的核酸分子；B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒；B8)含有B6)所述核酸分子的重组载体、或含有B7)所述表达盒的重组载体；B9)含有B6)所述核酸分子的重组微生物、或含有B7)所述表达盒的重组微生物、或含有B8)所述重组载体的重组微生物；B10)含有B6)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B7)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B8)所述重组载体的转基因植物细胞系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:降低所述0sMKK4表达的核酸分子为所述0sMKK4的反义基因。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:在核苷酸序列上，所述0sMKK4的反义基因与所述0sM KK4的编码基因反向互补。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述0sMKK4的编码基因是如下1)、2)或3):1)其编码序列是序列表中序列1的第1-1110位核苷酸的cDNA分子；2)在严格条件下与1)限定的cDNA分子杂交且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA ；3)与1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述0sMKK4的cDNA分子或基因组DNA。
8.根据权利要求4- 5中任一所述的应用，其特征在于:所述植物为水稻。
【文档编号】C12N15/82GK103667339SQ201310631714
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】李云海, 段朋根 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所