专利名称：：生物农药梧宁霉素在防治水稻稻瘟病中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一禾中由不吸水链霉菌梧州亚禾中(5Yr印Z:a^cesa力j^rosco/)ic"ss"Z^/x/r股/ro"e/7"s/7.."力印)产生的生物农药——梧宁霉素在防治水稻稻瘟病中的应用。
背景技术：
：我国是农业大国，常年种植粮食作物l亿公顷以上，棉花480万公顷以上，油料作物1400万公顷以上，蔬菜瓜果1800万公顷以上，常年需要防治面积超过3亿公顷。为了防治病虫害，保证农业的正常生产，长期以来，人们大量使用化学农药防治病虫害。化学农药的使用对保证农作物正常生产起到有效作用，但随着长期以来和大量使用化学农药，对生态环境已造成严重破坏，如土壤结构破坏、土壤中酶活性降低、土质和水体严重污染等等，破坏了整个生态环境，粮食、蔬菜、水果等几乎所有食品中有毒农药残留量严重超标，食用残留化学农药严重超标的瓜果蔬菜造成人畜中毒的事件也时有发生。针对中国入世，发达国家纷纷调整提高了产品进口的技术fj槛，农产品受到的影响首当其冲。我国仅农副产品因农药残留超标而遭国外"绿色壁垒"封杀的损失每年就高达70亿美元。发展无公害的生物农药是解决现有农药及农产品出口问题的主要途径。生物农药属于环境友好型产品，使用生物农药，不仅可以减少化学农药和化肥的使用，有效地实现农产品的优质安全生产，提升农产品的经济附加值,而且可为我国农产品出口创造有利条件，极大地增强我国农产品的国际竞争力。对我国推进绿色农业产业发展及发展农村经济、增加农民收入、促进农村繁荣具有重要的推进作用。水稻是我国主要的粮食作物，目前种植面积超过2800万公顷，年产量达1.7亿吨以上。每年由于病虫害的发生，都会造成大面积的减产，成为阻碍水稻高产的重要因素。水稻稻瘟病是水稻的主要病害，蔓延快，为害严重，防治不好会减产50%以上。现在防治稻瘟病的主要药剂有三环唑可湿性粉剂、施稻灵、稻瘟灵乳油、灭病威胶悬剂等，但均存药剂残留、环境污染、易产生抗性等问题。3梧宁霉素作为已知化合物，是由不吸水链霉菌梧外l亚种(5Yrepf^ycesaA仪ro义'opi6'"sot&ar股力owe"s2's几5〃fc/7)(《微生物学报》1988年，28巻(1)85-87页)产生的复合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白诺氏菌素和齒香菌素，除发明单位对梧宁霉素防治苹果腐烂病、苹果斑点落叶病以及番茄灰霉病等应用研究外，尚未见到其它单位将梧宁霉素作为生物农药还有其它新用途的相关报道。本发明目的是针对现有技术存在的缺陷，提供梧宁霉素的新用途，即梧宁霉素作为生物农药在防治水稻稻瘟病中的应用。本发明渉及由不吸水链霉菌梧少H亚禾中(5Yreptawyces3力j^n9sco;w'c〃s仰667.紛^o"e"hs/.(《微生物学报》1988年，28巻(1)85-87页)，产生的梧宁霉素作为生物农药在防治水稻稻瘟病中的应用。梧宁霉素是一种复合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白诺氏菌素和茴香菌素。根据梧宁霉素A1的核磁共振、红外吸收光谱、紫外吸收光谱以及质谱确定的分子量和其他一些理化数据，推导出梧宁霉素A1的分子式应为C,晶2N(X3，其化学结构式为收光谱以及质谱确定的分子量和其他一些理化数据，推导出梧宁霉素B化学结构式为:
发明内容法，通过核磁共振、红外吸收光谱、紫外吸根据类似梧宁霉素A1分离鉴定方法，通过核磁共振、红外吸收光谱、紫外吸收光谱以及质谱确定的分子量和其他一些理化数据，推导出梧宁霉素C化学结构式为<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>一、梧宁霉素对稻瘟病菌室内生物活性测定试验本实验采用生长速率法进行室内生物活性的测定，明确了梧宁霉素对水稻稻瘟病菌的抑制活性，确定梧宁霉素对水稻稻瘟病菌EC50、EC70、EC90,为该产品防治稻瘟病提供高技术资料和依据。1、材料与方法1.1供试材料稻瘟病菌、梧宁霉素、4%春雷霉素可湿性粉剂1.2试验方法1.2.1病原菌培养病原菌2次复壮后接种于培养基中，用灭菌的打孔器切取菌饼，备用。1.2.2供试药剂的配制将梧宁霉素配置成0.15、0.30、0.60、1.20、2.40Pg/ml5个梯度，阳性对照品4%春雷霉素可湿性粉剂根据田间使用剂量配制成40.0(^g/ml的浓度。1.2.3在无菌条件下，分别将各浓度剂量的样品及对照品，加入培养基中，充分混匀，等量导入培养皿中，制成相应浓度的含药平板。试验设加入等量无菌水的处理做空白对照。每个处理设6次重复。1.2.4在无菌条件下，将已经制备好的稻瘟病菌的菌饼接种于含药平板中央，菌丝面朝h，盖上皿盖，置25'C培养箱中培养。1.2.5调查方法根据空白对照培养皿中菌丝的生长情况调査病原菌菌丝生长情况。用卡尺测定菌落直径，单位为毫米。每个菌落用十字交叉垂直测定直径各一次，取其平均值。1.3数理统计与分析方法1.3.1计算方法根据调查结果，按照公式(1)(2)计算各处理浓度，稻瘟病菌的菌丝生长抑制率，单位为百分率，计算结果保留小数点后2位。D=Dl-D2....................................(1)式中D为菌落增长直径Dl为菌落直径6D2为菌盘直径D0-DtI二X100..................(2)DO式中I为菌丝生长抑制率DO为空白对照菌丝增长直径Dt为药剂处理菌丝增长直径1.3.2统计分析方法根据梧宁霉素的各浓度的对数X值，以相应处理对菌丝抑制率的几率值Y，用数理统计方法求出公式要记得毒力回归方程，求出EC50、EC70、EC90，用以评价梧宁霉素对稻瘟病病菌的抑制作用。釆用邓肯氏法差异显著性分析。2、结果与结论实验表明，梧宁霉素不同浓度处理均达到显著水平。毒力回归方程Y=4.0746+2.2304X，相关系数0.9836。根据方程计算出EC50=0.2600Pg/ml、EC70=0.4467lVml、EC90=0.976化g/ral，即供试药剂稀释5769倍时，对稻瘟病菌的抑制率可达50%;供试药剂稀释3358倍时，对稻瘟病菌抑制率达70%;当供试药剂稀释1536倍时，对稻瘟病菌抑制率达90%。结论梧宁霉素对稻瘟病菌有较高的生物活性。当药剂浓度在1.2-2.4^g/ml之间时，梧宁霉素对稻瘟病菌的抑制作用优于或接近于4%春雷霉素可湿性粉剂，但有效成分用量明显低于阳性对照。二、梧宁霉素防治水稻稻瘟病应用试验示范例1、试验示范l试验地点辽宁省丹东市东港市椅圈镇试验作物及品种水稻防治对象水稻稻瘟病(P/ric〃7ahaoir幼eCa力7页试验目的对梧宁霉素进行水稻稻瘟病的田间验证性试验，并对其安全性进行评价。环境条件该地块为插秧田，播种日期2007年4月15日，定植日期5月17日，株行距9X5cm，施复合肥50公斤，尿素45公斤。试验药剂梧宁霉素对照药剂75%三环唑可湿性粉剂用量与处理编号<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>使用方法喷雾法在稻瘟病发病前夕或发病初期进行第一次施药，共施药2-3次，间隔7天。试验周期和施药次数第一次施药2007年8月9日；第二次施药2007年8月20日调查方法分别于7月21日、二次施药后前天8月10日，调査两次。每小区5点取样，每点50穗，按照标准，记录发病情况，计算病情指数和防治效果。分级方法0级无病；l级每穗损失5%以下(个别枝梗发病)；3级每穗损失6-20%(1/3左右别枝梗发病)；5级每穗损失21-50%(穗颈或主轴发病，谷粒半瘪)；7级每穗损失51-70%(穗颈发病，大部分谷粒瘪)；9级每穗损失71-100%(穗颈发病，白穗)。8药效计算方法￡(各级病穗数x相对级别数)病情指数-X100调查总穗数X9CK0-PT1防治效果(％)=(1--)X100CK1-PTO式中CK0、CK1分别为空白对照区施药前、后的病情指数；PT0、PT1分别为药剂处理区<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)、结论采用邓肯氏新复极差法对结果进行统计分析。经方差分析表明试验药剂最高剂量防治效果高于阳性对照样品，且有效成分施药量明显低于阳性对照。试验药剂防治水稻稻瘟病于水稻稻瘟病发病前或初期施药，连续用2-3次，每亩药液量为50升，可有效防止水稻稻瘟病，且在实验过程中对水稻生长无不良影响，未见药害。2、试验示范2试验地点黑龙江富锦市农技中心试验田试验作物及品种水稻防治对象水稻稻瘟病(/^""///wao/yzaeCa。试验目的对梧宁霉素进行水稻稻瘟病的田间验证性试验，并对其安全性进行评价。环境条件试验田为老稻田地，土壤为白浆化草甸，土肥力中等，亩施40%土配方肥25公斤，尿素10公斤。2007年4月15日育苗，5月25日插秧，插秧规格30cmx10cm-—2-3株。试验药剂梧宁霉素对照药剂25%百克乳油用量与处理编号处理编号药剂施药剂量施药量(有效成分量)(1)梧宁霉素1000倍1.5mg/kg(2)梧宁霉素1250倍1.2rag/kg(3)梧宁霉素1500倍1.0mg/kg(4)阳性对照25%百克乳油2000倍225mg,/kg(5)空白——使用方法喷雾法叶面喷雾，没处理3升药液，重复4次。试验周期和施药次数7月21叶瘟初发期和7月30R两次施药。调查方法分别于8月9日、8月20日、8月28日调査三次。每小区5点取样，每点50穗，每次施肥前和最后一次施肥后7天，按照标准，记录发病肯况，计算病情指数和防治效果。分级方法0级无病；l级叶片病斑少于5个，长度小于lcm;3级叶片病斑6-10个，部分病斑长度大于lcm;5级叶片病斑11-25个，部分病斑连成片，占叶面积10-25%;7级叶片病斑26个以上，病斑连成片，占叶面积26-50%;9级叶片病斑连成片，占叶面积250%以上。药效计算方法病穗(叶、粒率)(%)自穗(叶、粒率)数X100调杳总病穗(叶、粒率)数￡(各级病穗数x相对级别数)病情指数-X100调査总德数X9CKO-PT1防治效果(％)=(1--)X100CKl—PTO式中CK0、CK1分别为空白对照区施药前、后的病情指数；PT0、PT1分别为药剂处理区施药前、后的病情指数。11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、结论调查结果表明，对照药剂处理对稻瘟病表现出明显的防治效果，二次施药后10天，对叶瘟病防效为82.66%。试验药剂梧宁霉素随着施药剂量增加，对稻瘟病防效提高。实验数据应用邓肯氏新复极差法统计分析结果为梧宁霉素IOOO倍稀释液防效效果高于阳性对照药剂，且施药量明显低于阳性对照药剂。施药后观察，梧宁霉素处理水稻生长正常，无药害发生。从以上试验结果，可以得出木发明与现在技术相比，具有下述有益效果1、通过室内和田间试验证明梧宁霉素1000倍稀释液防治水稻稻瘟病效果优于4%春雷霉素可湿性粉剂、75%三环唑可湿性粉剂和25%百克乳油，而且施药量明显低于阳性对照，这就说明使用梧宁霉素不仅可减少农业生产成本，提高防效，而且可以与其它生物农药交替使用，减缓抗性的产生；2、梧宁霉素对革兰氏阴性、阳性细菌、酵母以及丝状真菌(包括病原真菌)等有抑制作用，且对苹果腐烂病防治效果达％%以上，对水稻稻瘟病、苹果斑点落叶病以及番茄灰霉病也有良好的防治效果，且具有广谱性；3、梧宁霉素是一株菌同时产生的含有4种成分的生物抗生素，属于环境友好型农药，且多种抗生素协同作用，可减少其它农药的使用，对维护生态环境有一定意义；4、梧宁霉素经试验证明是低毒的。急性毒性LD50为4000mg/kg，皮肤和粘膜刺激都无异常反应，Ames试验，CHL-1细胞SCE致突变和微核试验均为阴性。蓄积性毒性试验检査结果表明各器官均无明显异常，蓄积系数大于5.6,以上说明梧宁霉素毒性很低，急性毒性和食盐和小苏打相仿；具休实施方式通过下面给出的具体实施例，可以进一步了解本发明。但它们并不是对本发明保护范围的限制。实施例l:梧宁霉素发酵液的制备(1)种子发酵培养基每100毫升中含有黄豆饼粉1.0g，淀粉1.0g，葡萄糖0，7g，蛋白胨O.5g，硫酸镁0.03g，硫酸钹1.0g，磷酸氢二钾0.02g，.碳酸钙0.7g，氯化钠0.lg，植物油0.2g，PH自然；(2)深层发酵培养基每100毫升中含有葡萄糖2.5g，淀粉l,5g，玉米面1.0g，黄豆饼粉2，0g，蛋白胨(或玉米浆)0.5g，硫酸铵0.2g，硫酸镁0.03g，磷酸氢二钾0.02g，碳酸钙0.7g，氯化钠O.lg，植物油0.2g，灭菌后添加培养基体积0.4%的正丙醇，PH自然。(3)种子发酵液的制备按5-20%的接种量取不吸水链霉菌梧州亚种(^5Yr印tc^yc^s力國rgroscopicu5脂z/oue/7Sj's几5u/s;)菌株，于25—35。C在禾中子发酵培养基中培养20-24小时，通风量1:0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，制取种子发酵液备用；(4)梧宁霉素发酵液的制备按5-20%的接种量取上述种子发酵液于25-35'C进行深层发酵培养，通风量前期0-12小时、中期12-40小时、后期40-42小时1:0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，接种量5-20%，发酵周期64-72小时，得到梧宁霉素发酵液。实施例2-11:梧宁霉素防治水稻稻瘟病应用实例13梧宁霉素防治水稻稻瘟病田间药效试验原始数据统计表(辽宁省丹东市东港市椅圈镇)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1、由不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygoscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)产生的梧宁霉素作为生物农药在防治水稻稻瘟病中的应用。全文摘要本发明公开了由不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)产生的生物农药梧宁霉素在水稻稻瘟病防治中的新用途。梧宁霉素是一种复合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白诺氏菌素和茴香菌素，对苹果腐烂病防治率可达95％以上。本发明通过室内和田间试验证明，梧宁霉素1000倍稀释液防治水稻稻瘟病效果优于4％春雷霉素可湿性粉剂、75％三环唑可湿性粉剂和25％百克乳油，而且施药量明显低于阳性对照。使用梧宁霉素不仅可以减少农业生产成本，提高防效，而且可以与其他生物农药交替使用，减缓抗性的产生；梧宁霉素对水稻稻瘟病有良好的防治效果，且无环境污染、药剂残留等问题，属于环境友好型农药，是一种具有良好开发应用前景的生物农药。文档编号A01N43/90GK101632367SQ20081001250公开日2010年1月27日申请日期2008年7月24日优先权日2008年7月24日发明者关艳丽,吴红艳,莉李,桓明辉,池景良,浩田,郭玲玲,飞陈,韩希军申请人:辽宁省微生物科学研究院