一种从米糠高温粕中制备米糠多肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从米糠高温粕中制备米糠多肽的方法，步骤如下：（1）碱提：将米糠高温粕按照料液质量比1:10～12加水搅拌均匀，调节pH至11～11.5，于50℃碱提2h，离心得上清液，上清液pH值调至4.6，静置1h，再次离心获得米糠蛋白；（2）一次酶解：米糠蛋白加入适量水搅拌均匀，调节pH至6.8～7.0，加热至50℃至米糠蛋白全部溶解，加入适量风味蛋白酶于50～55℃酶解2.5～3h，酶解过程中维持酶解液pH值6.8～7.0，灭酶离心获得一次酶解上清液；（3）二次酶解：一次酶解上清液调pH值至碱性，加入碱性蛋白酶于50～60℃酶解2.5～3h，酶解过程中维持酶解液pH值呈碱性，灭酶离心获得二次酶解上清液；（4）浓缩和干燥。该方法制备的米糠多肽氨基酸种类丰富，提取率高，杂质含量低，溶解度高。
【专利说明】一种从米糠高温粕中制备米糠多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备多肽的方法，具体的说是涉及一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法。
【背景技术】
[0002]米糠高温柏是米糠经过高温提油后的产物，因受高温影响，其可溶性蛋白的含量减少，导致了其提取率的减小，且提取的蛋白中杂质较多，即蛋白含量不高，另外，提取的蛋白溶解度不高，而蛋白质的溶解度影响其能否在食品中得到广泛应用的重要因素之一。为充分利用米糠高温柏资源，进一步提高米糠蛋白溶解性，强化其功能特性，拓宽其在食品中的应用，宜利用米糠高温柏制备米糠多肽。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于解决现有技术从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法提取率低，且提取的多肽杂质多及溶解度不高的不足，提供一种新的从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法。该方法利用风味蛋白酶和碱性蛋白酶分步水解，制备氨基酸种类丰富和营养全面的米糠多肽，提取率高，获 得的米糠多肽中杂质含量低，溶解度高，能广泛应用于食品领域中。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0005]一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，所述制备方法包括下列步骤:
[0006](I)碱提:将米糠高温柏按照料液质量比1:10~12加水搅拌均匀，调节pH至11~11.5，于50°C碱提2h，然后离心得上清液，所述上清液pH值调至4.6，静置lh，再次离心，去除上清液获得米糖蛋白；
[0007](2 )一次酶解:将步骤(1)获得的米糠蛋白加入适量水搅拌均匀，调节pH至6.8~
7.0，加热至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入适量风味蛋白酶于50~55°C酶解2.5~3h，酶解过程中维持酶解液pH值6.8~7.0，酶解结束后灭酶，然后离心去除沉淀，获得一次酶解上清液；
[0008](3) 二次酶解:将步骤(2)的一次酶解上清液调pH值至碱性，加入碱性蛋白酶于50~60°C酶解2.5~3h，酶解过程中维持酶解液pH值呈碱性,酶解完成后灭酶,然后离心去除沉淀，获得二次酶解上清液；
[0009](4)浓缩和干燥:将步骤(3)获得的二次酶解上清液进行脱盐处理后，然后经过真空浓缩后冷冻干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0010]作为优选，步骤(2)中米糠蛋白(以干基计)与水的质量比为:1:2，风味蛋白酶的添加量为米糠蛋白干基质量的0.5%，风味蛋白酶的活性为20000U/g。
[0011]作为优选，步骤(3) 二次酶解中碱性蛋白酶的添加量为米糠蛋白干基质量的0.28%，碱性蛋白酶的活性为20万U/g。
[0012]更优选，步骤(3)中二次酶解的温度为54°C，pH为9.4，酶解时间为3.0h。pH对酶反应的影响，主要表现对在酶活力的影响，过酸或过碱都会影响其活性，发明人经过试验研究发现当二次酶解的PH值从8到9.5时，酶解效率渐高，再增大pH值，其酶解效率反而降低，这表面碱性蛋白酶显著的酶活性只发生在非常窄的PH值范围内，碱性蛋白酶和底物的蛋白质都含有解离基团，只有这些解离基团处于特定的解离状态时，碱性蛋白酶与底物蛋白才结合最快，生成产物的速度最快，体系的PH值直接影响着酶和底物蛋白质分子的某些解离基团的解离状态，只有在特定的PH值条件下，酶和底物蛋白质的解离基团才处于结合和转化为产物的最佳解离状态，本发明确定的最佳二次酶解pH值为9.4，此时碱性蛋白酶对米糠蛋白底物的酶解效率最高。
[0013]作为优选，步骤(2) —次酶解中灭酶温度为90°C，时间为lOmin，离心的转速为4000~4500rpm,离心时间为20~25min。
[0014]作为优选，步骤(3) 二次酶解中灭酶温度为85，°C时间为lOmin，离心的转速为4000~4500rpm,离心时间为10~15min。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]( I)本发明先通过碱溶酸沉获得米糠蛋白，然后进一步通过双酶法酶解米糠蛋白制备米糠多肽，工艺设计合理，反应条件温和，具有酶解效率高，米糠多肽产率高、生产成本低的优点，易于实现产业化。
[0017](2)本发明利用双酶法制备的米糠多肽氨基酸种类丰富，含有17种氨基酸，除去色氨酸(检测时被破坏)，还含有另外7中必需氨基酸，且其第一限制性氨基酸赖氨酸含量很好，占总氨基酸含量的7.2%， 蛋氨酸和半胱氨酸含量也占氨基酸总量的6.7%，营养价值十分丰富。
[0018](3)本发明利用双酶法制备的米糠多肽的分子量主要集中在180Da~500Da之间，占全部米糠多肽的50.38%左右；分子量500Da~1000Da之间的多肽占全部米糠多肽的21.25%左右，米糠多肽的分子量小，吸收利用率高，进一步强化了米糠多肽的营养价值。
【具体实施方式】
[0019]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明，各实施例使用的仪器设备均系市购常规设备，各实施例所使用的试剂均系市购常规试剂。
[0020]碱性蛋白酶酶活:20万U/g ;风味蛋白酶酶活:20000U/g。
[0021]米糠多肽分子量测定方法:采用Waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器、Empower工作站和GPC软件)，对制备的米糠多肽的分子量分布进行测定:色谱柱选用TSKgel2000SWXL300mmX7.8_，流动相:乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1 (V/V)，检测波长:220nm，流速:0.5mL/min ;柱温:30°C，进样体积:10μ I。以细胞色素C (Mwl2500);杆菌酶(Mwl450);乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw451);乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mwl89)为分子量参照物。
[0022]( I)分子量标准曲线的绘制
[0023]以上述4个标准蛋白质分子质量的对数为纵坐标，保留时间为横坐标的IgMw迁移率图，即分子量标准曲线，并建立线性回归方程。
[0024](2)米糠多肽分子量分布测定
[0025]采用HPLC测定其分子量分布，测定条件及样品制备同上。测定出的分子质量分布图结合分子量标准曲线用GPC软件进行分析，以不同分子量范围内的峰面积百分比为该分子量分布范围内多肽所占的百分比。
[0026]米糠多肽氨基酸含量测定:中国农业科研院油料作物研究所测试中心。
[0027]实施例1~3所使用的原料:米糠高温柏的蛋白质含量79.56%，水分含量7.55%，灰分含量1.79%ο
[0028]实施例1:
[0029]一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，所述制备方法包括下列步骤:
[0030](1)碱提:将米糠高温柏按照料液质量比1:10加水搅拌均匀，调节pH至11，于50°C碱提2h，然后离心得上清液，离心的转速为4000rpm，离心时间为25min，所述上清液pH值调至4.6,静置Ih,再次以4000rpm的转速离心25min,去除上清液获得米糠蛋白；
[0031 ] (2) 一次酶解:将步骤(1)获得的米糠蛋白加入适量水搅拌均匀，使得米糠蛋白的质量分数为33.3%，调节pH至6.8，加热至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白质量
.0.5%的风味蛋白酶于50°C酶解3h，酶解过程中维持酶解液pH值6.8，酶解结束后于90°C灭酶lOmin，然后离心去除沉淀，获得一次酶解上清液，离心的转速为4000rpm，离心时间为25min ；
[0032](3) 二次酶解:将步骤(2)的一次酶解上清液调pH值至9.0，加入米糠蛋白质量
0.2%的碱性蛋白酶于50°C酶解3h，酶解过程中维持酶解液pH值9.0,酶解完成后于85°C灭酶lOmin，然后在转速为4000rpm条件下离心IOmin去除沉淀，获得二次酶解上清液；
[0033](4)浓缩和干燥:将步骤(3)获得的二次酶解上清液过阴阳离子交换树脂进行脱盐处理后，然后经过真空浓缩后冷冻干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0034]实施例2:
[0035]一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，所述制备方法包括下列步骤:
[0036](1)碱提:将米糠高温柏按照料液质量比1:12加水搅拌均匀，调节pH至11.5，于50°C碱提2h，然后离心得上清液，离心的转速为4500rpm，离心时间为20min，所述上清液pH值调至4.65，静置lh，再次以4500rpm的转速离心20min，去除上清液获得米糠蛋白；
[0037](2) 一次酶解:将步骤(1)获得的米糠蛋白加入适量水搅拌均匀，使得米糠蛋白的质量分数为33.3%，调节pH至7.0，加热至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白质量
0.5%的风味蛋白酶于55°C酶解2.5h，酶解过程中维持酶解液pH值7.0，酶解结束后于90°C灭酶lOmin，然后离心去除沉淀，获得一次酶解上清液，离心的转速为4500rpm，离心时间为20min ；
[0038](3) 二次酶解:将步骤(2)的一次酶解上清液调pH值至10.0，加入米糠蛋白质量0.3%的碱性蛋白酶于60°C酶解2.5h，酶解过程中维持酶解液pH值10.0,酶解完成后于85°C灭酶lOmin，然后在转速为4500rpm条件下离心15min去除沉淀，获得二次酶解上清液；
[0039](4)浓缩和干燥:将步骤(3)获得的二次酶解上清液过阴阳离子交换树脂进行脱盐处理后，然后经过真空浓缩后冷冻干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0040]实施例3:
[0041]一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，所述制备方法包括下列步骤:
[0042](1)碱提:将米糠高温柏按照料液质量比1:11加水搅拌均匀，调节pH至11.2，于50°C碱提2h，然后离心得上清液，离心的转速为4200rpm，离心时间为22min，所述上清液pH值调至4.62，静置lh，再次以4200rpm的转速离心21min，去除上清液获得米糠蛋白；
[0043](2) 一次酶解:将步骤(1)获得的米糠蛋白加入适量水搅拌均匀，使得米糠蛋白的质量分数为33.3%，调节pH至6.9，加热至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白质量
0.5%的风味蛋白酶于52°C酶解3h，酶解过程中维持酶解液pH值6.9，酶解结束后于90°C灭酶lOmin，然后离心去除沉淀，获得一次酶解上清液，离心的转速为4200rpm，离心时间为25min ；
[0044](3) 二次酶解:将步骤(2)的一次酶解上清液调pH值至9.4，加入米糠蛋白质量
0.28%的碱性蛋白酶于54°C酶解3h，酶解过程中维持酶解液pH值9.4，酶解完成后于85°C灭酶lOmin，然后在转速为4300rpm条件下离心12min去除沉淀，获得二次酶解上清液；
[0045](4)浓缩和干燥:将步骤(3)获得的二次酶解上清液过阴阳离子交换树脂进行脱盐处理后，然后经过真空浓缩后冷冻干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0046]实施例1~3制得的米糠多肽的分子量分布见表1。
[0047]表1米糠多肽的分子量分布
[0048]
【权利要求】
1.一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤: (O碱提:将米糠高温柏按照料液质量比1:10~12加水搅拌均匀，调节pH至11~11.5，于50°C碱提2h，然后离心得上清液，所述上清液pH值调至4.6，静置lh，再次离心，去除上清液获得米糖蛋白； (2)—次酶解:将步骤(1)获得的米糠蛋白加入适量水搅拌均匀，调节pH至6.8~7.0，加热至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入适量风味蛋白酶于50~55°C酶解2.5~3h，酶解过程中维持酶解液pH值6.8~7.0，酶解结束后灭酶，然后离心去除沉淀，获得一次酶解上清液； (3)二次酶解:将步骤(2)的一次酶解上清液调pH值至碱性，加入碱性蛋白酶于50~60°C酶解2.5~3h，酶解过程中维持酶解液pH值呈碱性，酶解完成后灭酶，然后离心去除沉淀，获得二次酶解上清液； (4)浓缩和干燥:将步骤(3)获得的二次酶解上清液进行脱盐处理后，然后经过真空浓缩后冷冻干燥，得到米糠蛋白多肽。
2.根据权利要求1所述的一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，其特征在于:步骤(2)中米糖蛋白(以干基计)与水的质量比为:1:2,风味蛋白酶的添加量为米糖蛋白干基质量的0.5%，风味蛋白酶的活性为20000U/g。
3.根据权利要求1所述的一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，其特征在于:步骤(3) 二次酶解中碱性蛋白酶的添加量为米糠蛋白干基质量的0.2~0.3%，碱性蛋白酶的活性为20万U/g。
4.根据权利要求3所述的一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，其特征在于:步骤(3)中二次酶解的温度为54°C，pH为9.4、加酶量为0.28%，酶解时间为3.0h。
5.根据权利要求1所述的一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，其特征在于:步骤(2) —次酶解中灭酶温度为90°C，时间为lOmin，离心的转速为4000~4500rpm，离心时间为20~25min。
6.根据权利要求1所述的一种从米糠高温柏中制备米糠多肽的方法，其特征在于:步骤(3) 二次酶解中灭酶温度为85°C，时间为lOmin，离心的转速为4000~4500rpm，离心时间为10~15min。
【文档编号】C12P21/06GK103627767SQ201310634437
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】何东平, 姚行权, 胡传荣, 姚行江, 张世宏, 邹翀, 尤梦圆, 吴建宝, 刘京伟 申请人:衢州刘家香食品有限公司