产量提高的植物的制作方法
【专利摘要】本发明一般涉及通过提高一种或多种增强植物中氮利用效率相关之多肽的活性而获得的与相应未转化野生型植物细胞相比具有增强的氮利用效率和/或提高的生物量产生的植物细胞。
【专利说明】产量提高的植物
[0001]本申请是申请日为2008年9月17日、发明名称为“产量提高的植物”的中国专利申请200880116390.1(国际申请号PCT/EP2008/062362)的分案申请。
[0002]本申请通过参考并入2007年9月18日提交的EP07117448.6以及2008年7月25日提交的 EP08161134.5。
[0003]本发明涉及分子生物学、植物遗传学、植物生理学和发育生物学领域。更具体地，本文公开的发明提供了含有 增强或提高转基因植物的一种或多种性状之核酸的植物细胞、包含这些细胞的植物、来自这些植物的后代、种子和花粉，以及产生和使用这些植物细胞或植物、后代、种子或花粉的方法。特别地，所述提闻的性状表现为提闻的广量，优选提闻的一种或多种产量相关性状.[0004]在大田条件下，植物的性能(例如在生长、发育、生物量累积和种子产生方面的性能)取决于植物对多种环境条件、改变和胁迫的耐性和适应能力。自从农业和园艺起源以来，在作物栽培中就存在对改进植物性状的需要。除了通过作物栽培的技术发展来提高产量以外，育种策略产生了抵抗生物及非生物胁迫的作物特性，以提高养分使用效率和改变其他作物特异性产量参数。改善了植物的固有生长及发育特征，并引入了对生物及非生物胁迫的耐性，以在环境胁迫条件下维持产量，并扩展不同气候条件下的栽培面积。开发了具有更好的养分利用效率的作物，以减少肥料输入，并将栽培面积扩展到土壤养分贫瘠的地区。
[0005]植物是固着生物，因此需要应对各种环境胁迫。生物胁迫(如植物害虫和病原体)和非生物胁环境迫是植物生长和生产力的重要限制因素(Boyer, Plant Productivity andEnvironment, Science218, 443 - 448(1982);Bohnert 等,Adaptations to EnvironmentalStresses, Plant Cell7 (7)，1099-1111 (1995))，因此限制了植物的栽培和地理分布。接触不同胁迫的植物通常具有较低产量的植物材料、种子、果实和其他产品。由这些胁迫导致的作物损失和作物产量损失(如水稻、玉蜀黍(玉米)、油菜(包括冬季油菜和芸苔)、棉花、大豆和小麦)代表了重要的经济和政治因素，并造成了食品短缺，特别是在许多不发达国家中。
[0006]目前进行作物及园艺改进的常规方法利用选择性育种技术来鉴定具有期望特征的植物。然而，这些常规技术具有一些缺点。含有异源遗传组分的植物常常不总能产生从亲本植物中传递过来的期望性状，特别是在不产生其他负影响的情况下。因此，特别复杂的性状(如产量和胁迫现象)使得通过常规育种方法进行遗传优化十分困难、昂贵且耗时。相反，分子生物学的发展使得可以以特异性方式修饰植物的种质。例如，在一些情况下，对单基因的修饰导致例如胁迫耐性(Wang等，2003)和其他产量相关性状显著提高。由于不同的植物在不同栽培地区需要抵抗不同类型和强度的胁迫，因此仍需要鉴定显示多种胁迫抗性组合的基因来产生优化的产量。仍需要鉴定能从总体上提高植物产量的基因。
[0007]本发明提供了包含一种或多种增强或改进转基因植物一种或多种性状之核酸的转基因植物细胞核和/或转基因植物细胞、包含这些细胞的植物、来自这些植物的后代、种子和花粉，以及产生和使用这些植物细胞或植物、后代、种子或花粉的方法。特别地，所述改进的性状表现为提高的产量。[0008]在一个实施方案中，本发明提供了通过提高或产生选自以下的一种或多种活性来产生这些转基因植物细胞或植物的方法:2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxy-phosphoheptonate aldolase)、3_酮固醇还原酶、60S核糖体蛋白、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、腺苷酸激酶、烷基氢过氧化物还原酶、烷基/芳基硫酸酯酶、α-葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、分裂后期促进复合物(APC)亚基、抗病毒衔接蛋白、芳族氨基酸氨基转移酶I1、ARVl蛋白、自吞噬特异性磷脂酰肌醇-3激酶复合体蛋白亚基、b0017-蛋白、B0165-蛋白、B1258-蛋白、B1267-蛋白、B1381-蛋白、bl933_ 蛋白、b2165_ 蛋白、b2238_ 蛋白、b2431_ 蛋白、B2646-蛋白、b2766-蛋白、b3120_蛋白、肉碱乙酰基转移酶、细胞壁内-β_1，3_葡聚糖酶、分子伴侣、几丁质合酶3复合体蛋白、磷酸胆碱胞苷酰转移酶、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶(双功能)、网格蛋白相关蛋白复合体小亚基、RAM信号网络的组分、半胱氨酸转运蛋白、细胞色素c氧化酶亚基VII1、胞质溶胶过氧化氢酶、胞质溶胶丝氨酸羟甲基转移酶、二氢乳清酸脱氢酶、二氢神经鞘氨醇磷酸酯裂合酶、核糖核酸外切酶、F1F0ATP合酶β亚基、因子停滞蛋白、G蛋白偶联外激素受体受体、Y-谷氨酰激酶、葡糖淀粉酶、甘油-3-磷酸转运蛋白亚基、甘氣酸脱竣酶、糖基转移酶、闻尔基体?旲交换因子亚基、闻尔基体?旲蛋白、GP1-锚着细胞壁蛋白、GTP结合蛋白、与肌醇/胆碱应答元件结合的螺旋-环-螺旋转录激活子、己糖转运蛋白、调节渗透感受MAP激酶级联的组氨酸激酶渗透感受器、水解酶、羟胺还原酶、羟基十四酰酰基载体蛋白脱水酶、过氧化物酶体遗传蛋白、定位于晚期高尔基泡的膜内在蛋白、铁硫簇装配蛋白、异构酶、赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基、赖氨酸特异性金属蛋白酶、溶血磷脂酶、Mcmlp结合转录阻抑物、减数分裂重组蛋白、膜蛋白、金属离子转运蛋白、微粒体β_酮还原酶、线粒体内膜间隙蛋白、线粒体蛋白、线粒体核糖体蛋白大亚基、线粒体核糖体蛋白小亚基、线粒体丝氨酰-tRNA合成酶、钥喋呤生物合成蛋白、肌醇转运蛋白、非必需动粒蛋白、非必需Ras鸟苷酸交换因子、Ras样蛋白Rho/Rac亚家族的非必需小GTP酶、核帽结合蛋白复合体亚基、核融合蛋白前体、核孔复合体亚基、起点识别复合体亚基、外膜引导蛋白 、氧化还原酶、肽转运蛋白、肽酰-脯氨酰顺反异构酶、PhoH-样蛋白、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、葡糖磷酸变位酶/磷酸甘露糖变位酶、磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、钾:氢反向转运蛋白、脯氨酸脱氢酶、核糖体大亚基的蛋白质组分、参与shmoo形成和双极出芽位点选择的蛋白质、参与鞘脂生物合成的蛋白质、蛋白激酶、含有L-A双链RNA的微粒的结构稳定性所必需的蛋白质、核糖体RNA成熟所需的蛋白质、蛋白质移位酶蛋白、调节性CAT8蛋白、Glc7pl型蛋白丝氨酸-苏氨酸磷酸酶的调节性亚基、26S蛋白酶体的调节性亚基、Gl转录的阻抑物、Rho GDP-解离抑制子、核糖核蛋白、核糖体蛋白小亚基、RNA聚合酶III亚基、酵母氨酸脱氢酶、短链脂肪酸转运蛋白、信号识别颗粒亚基(SRP54 )、信号转导MEK激酶、用于mRNA剪接的SM复合体B蛋白、纺锤体检查点复合体亚基、剪接因子、稳定期蛋白、胞质苯丙氨酰-tRNA合成酶亚基、顺面高尔基体转运蛋白颗粒(TRAPP)复合体亚基、苏氨酸脱氨酶、转录延伸因子、转录因子、转录激活子、翻译延伸因子EF-3(HEF3)、在细胞壁多聚体组成中发挥作用的跨膜蛋白、转运蛋白、泛素调节蛋白、UDP-N-乙酰基-葡糖胺-1-P转移酶、v-SNARE结合蛋白、参与高尔基体转运的v-SNARE蛋白、木糖醇脱氢酶、yalO 19w蛋白、ybr262c蛋白、YDR070C蛋白、ydr355c蛋白、YFR007W蛋白、ygrl22c_a 蛋白、ygr266w 蛋白、ygr290w 蛋白、YHL005C 蛋白、yhl021c 蛋白、yhrl27w 蛋白、YJLOIOC 蛋白、yjl064w 蛋白、yjl067w 蛋白、yjl213w 蛋白、ykllOOc 蛋白、YKL111C 蛋白、ykll31w 蛋白、ykr016w 蛋白、ykr021w 蛋白、yll014w 蛋白、y11023c 蛋白、yll037w 蛋白、yll049w 蛋白、ylr042c 蛋白、YLR053C 蛋白、ylr065c 蛋白、ylrl25w 蛋白、ylr404w 蛋白、ylr463c 蛋白、yml089c 蛋白、YML101C 蛋白、ymll28c 蛋白、YMR082C 蛋白、YMR126C 膜蛋白、YMR144W 蛋白、YMR160W 蛋白、YMR209C 蛋白、YMR233W 蛋白、YNL320W 蛋白、Y0R097C 蛋白、Y0R203W蛋白、YPL068C蛋白、锌指蛋白和锌金属蛋白酶。
[0009] 在一个实施方案中，通过提高具有选自以下之活性的一种或多种蛋白质的量和/或活性来提高所述活性，并且其中这一种或多种蛋白质各包含如表1I第5列或第7列所示多肽:2_脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、3-酮固醇还原酶、60S核糖体蛋白、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、腺苷酸激酶、烷基氢过氧化物还原酶、烷基/芳基硫酸酯酶、α -葡糖苷酶、α -甘露糖苷酶、分裂后期促进复合物(APC)亚基、抗病毒衔接蛋白、芳族氨基酸氨基转移酶I1、ARVl蛋白、自吞噬特异性磷脂酰肌醇-3激酶复合体蛋白亚基、b0017-蛋白、B0165-蛋白、B1258-蛋白、B1267-蛋白、B1381-蛋白、bl933_ 蛋白、b2165_ 蛋白、b2238_ 蛋白、b2431-蛋白、B2646-蛋白、b2766-蛋白、b3120_蛋白、肉碱乙酰基转移酶、细胞壁内-β-1，3-葡聚糖酶、分子伴侣、几丁质合酶3复合体蛋白、磷酸胆碱胞苷酰转移酶、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶(双功能)、网格蛋白相关蛋白复合体小亚基、RAM信号网络的组分、半胱氨酸转运蛋白、细胞色素c氧化酶亚基VII1、胞质溶胶过氧化氢酶、胞质溶胶丝氨酸羟甲基转移酶、二氢乳清酸脱氢酶、二氢神经鞘氨醇磷酸酯裂合酶、核糖核酸外切酶、F1F0ATP合酶β亚基、因子停滞蛋白、G蛋白偶联外激素受体受体、Y-谷氨酰激酶、葡糖淀粉酶、甘油-3-磷酸转运蛋白亚基、甘氨酸脱羧酶、糖基转移酶、高尔基体膜交换因子亚基、高尔基体膜蛋白、GP1-锚着细胞壁蛋白、GTP-结合蛋白、与肌醇/胆碱应答元件结合的螺旋-环-螺旋转录激活子、己糖转运蛋白、调节渗透感受MAP激酶级联的组氨酸激酶渗透感受器、水解酶、羟胺还原酶、羟基十四酰酰基载体蛋白脱水酶、过氧化物酶体遗传蛋白、定位于晚期高尔基泡的膜内在蛋白、铁硫簇装配蛋白、异构酶、赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基、赖氨酸特异性金属蛋白酶、溶血磷脂酶、Mcmlp结合转录阻抑物、减数分裂重组蛋白、膜蛋白、金属离子转运蛋白、微粒体β_酮还原酶、线粒体内膜间隙蛋白、线粒体蛋白、线粒体核糖体蛋白大亚基、线粒体核糖体蛋白小亚基、线粒体丝氨酰-tRNA合成酶、钥喋呤生物合成蛋白、肌醇转运蛋白、非必需动粒蛋白、非必需Ras鸟苷酸交换因子、Ras样蛋白Rho/Rac亚家族的非必需小GTP 酶、核帽结合蛋白复合体亚基、核融合蛋白前体、核孔复合体亚基、起点识别复合体亚基、外膜引导蛋白、氧化还原酶、肽转运蛋白、肽酰-脯氨酰顺反异构酶、PhoH-样蛋白、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、葡糖磷酸变位酶/磷酸甘露糖变位酶、磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、钾:氢反向转运蛋白、脯氨酸脱氢酶、核糖体大亚基的蛋白质组分、参与shmoo形成和双极出芽位点选择的蛋白质、参与鞘脂生物合成的蛋白质、蛋白激酶、含有L-A双链RNA的微粒的结构稳定性所必需的蛋白质、核糖体RNA成熟所需的蛋白质、蛋白质移位酶蛋白、调节性CAT8蛋白、Glc7pl型蛋白丝氨酸-苏氨酸磷酸酶的调节性亚基、26S蛋白酶体的调节性亚基、Gl转录的阻抑物、Rho GDP-解离抑制子、核糖核蛋白、核糖体蛋白小亚基、RNA聚合酶III亚基、酵母氨酸脱氢酶、短链脂肪酸转运蛋白、信号识别颗粒亚基(SRP54)、信号转导MEK激酶、用于mRNA剪接的SM复合体B蛋白、纺锤体检查点复合体亚基、剪接因子、稳定期蛋白、胞质苯丙氨酰-tRNA合成酶亚基、顺面高尔基体转运蛋白颗粒(TRAPP)复合体亚基、苏氨酸脱氨酶、转录延伸因子、转录因子、转录激活子、翻译延伸因子EF-3(HEF3)、在细胞壁多聚体组成中发挥作用的跨膜蛋白、转运蛋白、泛素调节蛋白、UDP-N-乙酰基-葡糖胺-1-P转移酶、v-SNARE结合蛋白、参与高尔基体转运的v-SNARE蛋白、木糖醇脱氢酶、yal019w蛋白、ybr262c蛋白、YDR070C蛋白、ydr355c蛋白、YFR007W 蛋白、ygrl22c-a 蛋白、ygr266w 蛋白、ygr290w 蛋白、YHL005C 蛋白、yhl021c蛋白、yhrl27w 蛋白、YJL010C 蛋白、yjl064w 蛋白、yjl067w 蛋白、yjl213w 蛋白、ykllOOc 蛋白、YKLlIIC 蛋白、ykll31w 蛋白、ykr016w 蛋白、ykr021w 蛋白、yll014w 蛋白、y11023c 蛋白、yll037w 蛋白、yll049w 蛋白、ylr042c 蛋白、YLR053C 蛋白、ylr065c 蛋白、ylrl25w 蛋白、ylr404w 蛋白、ylr463c 蛋白、yml089c 蛋白、YML101C 蛋白、ymll28c 蛋白、YMR082C 蛋白、YMR126C 膜蛋白、YMR144W 蛋白、YMR160W 蛋白、YMR209C 蛋白、YMR233W 蛋白、YNL320W 蛋白、Y0R097C蛋白、Y0R203W蛋白、YPL068C蛋白、锌指蛋白和锌金属蛋白酶。
[0010]本发明所述提高的产量一般可通过增强或改善(与未转化起始植物或野生型植物相比)植物的一种或多种产量相关性状来实现。导致产量提高的这些对植物产量相关性状的改善包括但不仅限于提高植物的固有产量能力，改善养分使用效率和/或提高的胁迫耐性。
[0011]根据本发明，与提高植物内在产量能力相关的产量相关性状可表现为提高的特异性(固有)种子产量(例如提高的种子/籽粒大小、提高的穗数、提高的每穗种子数、改善的种子饱满度、改善的种子组成、胚和/或胚乳的改进等)、修饰和改进植物的内在生长和发育机制(如植物高度、植物生长率、荚果数、荚果在植物上的位置、节间数、荚果破裂的发生率、结瘤和氮固定的效率、碳同化作用的效率、幼苗活力/早期活力的改进、增强的萌发(在胁迫或非胁迫条件下)效率、植物结构的改进、细胞周期的改变、光合作用的改变、多种信号途径的改变、转录调节的改变、翻译调节的改变、酶活性的改变等)和/或其他。
[0012]根据本发明，与植物的养分使用效率提高或增加相关的产量相关性状可表现为改进的植物一般养分同化作用效率(例如一般养分摄入和/或转运的改进、植物的一般转运机制的改进、同化作用途径的改进等)和/或改进特定养分的使用效率，包括但不仅限于磷、钾和氮。
[0013]根据本发明，与植物胁`迫耐性的改进或提高相关的产量相关性状可表现为改进或提高植物针对胁迫(特别是非生物胁迫)的耐性。在本申请中，非生物胁迫一般指植物通常面对的非生物环境条件，包括一般称为“非生物胁迫”条件的条件，包括但不仅限于干旱(对干旱的耐性可通过改进水利用效率来获得)、热、低温和冷条件(如冰冻和寒冷条件)、盐度、渗透压胁迫、掩蔽、高植物密度、机械胁迫、氧化胁迫等。
[0014]根据本发明，涉及植物内在产量能力提高和/或植物对非生物胁迫的耐性的产量相关性状改进是用于增强或改进所述植物产量的特别优选的实施方案。
[0015]本文使用的术语“产量” 一般指来自植物(特别是作物)的可测量的生产。
[0016]产量和产量提高(与未转化起始植物或野生型植物相比)可通过多种方式来测量，应该理解，本领域技术人员能够根据具体的实施方案、相关的具体作物以及特定的目的或相关应用来应用正确的含义。
[0017]在本发明优选的实施方案中，产量提高指生物量产量提高、种子产量提高和/或完整植物或其部分或植物种子中一种或多种特定含量的提高。
[0018]在优选的实施方案中，“产量”指生物量产量，包括干重生物量产量和/或鲜重生物量产量，其根据具体的情况(测试条件、特定的目的作物、目的应用等)各自涉及植物的地上部分和/或地下部分。在每种情况下，生物量产量均可基于鲜重、干重或根据湿度调整的基础来计算，另一方面，可基于每株植物或特定面积(如每英亩/平方米的生物量产量等)来计
笪
[0019]在另一些优选的实施方案中，“产量”指种子产量，其可通过以下一种或多种参数来测量:种子数或饱满种子数(每株植物或每单位面积(英亩/平方米等))、种子饱满率(饱满种子数与种子总数的比值)、每植物的花数、种子生物量或种子总重(每株植物或每单位面积(英亩/平方米等))、千粒重(TKW，由计数的饱满种子数及其总重来外推，TKW的提高可由种子大小提高、种子重量提高、胚大小提高和/或胚乳提高所致)或者允许测量种子产量的其他参数。种子产量可基于干重或鲜重来计算，或者一般基于湿度调整(如15.5%湿度)来计算。
[0020]在其他优选的实施方案中，产量指可收获产品中的特定含量和/或组成，包括但不仅限于增强和/或改进的糖含量或糖组成、增强或改进的淀粉含量和/或淀粉组成、增强和/或改进的油含量和/或油组成(如增强的种子油含量)、增强或改进的蛋白质含量和/或蛋白质组成(如增强的种子蛋白质含量)、增强和/或改进的维生素含量和/或维生素组成等。
[0021]在根据本申请的一个优选含义中，本文所述“产量”还可指植物的可收获产量，其在很大程度上取决于特定的目的植物/作物以及各个特定情况下的预期的目的应用(如食物生产、饲料生产、加工食品生产、生物燃料、沼气或醇生产等)。因此，产量还可以基于收获指数(表示为相应可收获部分重量除以总生物量的比值)、每单位面积(英亩、平方米等)的可收获部分重量等。
[0022]优选地，本文所述优选的增强或改进的植物产量特征可在存在或不存在胁迫条件的情况下实现。
[0023]因此，“产量”的含义主要取决于目的作物及其预期应用，应该理解，本领域技术人员会明白在各种具体情况下其在环境描述中的含义。
[0024]在本发明的一个优选实施方案中，通过提高一种或多种产量相关性状来提高植物产量，所述产量相关性状选自与光合作用活性生物(特别是植物)的养分利用效率相关的一种或多种改进。植物养分利用效率的改进或提高可表现为改进植物的总体养分同化效率(例如改善总体养分摄入和/或转运，改善植物的总体转运机制、同化途径的改进等)和/或改进特定养分(包括但不仅限于磷、钾和氮)的利用效率。
[0025]术语“养分缺乏”指相应的光合作用生物(特别是植物)缺少养分(如磷、钾或氮)的条件，特别地，“氮缺乏”指相应光合作用生物(特别是植物)缺少氮的条件。
[0026]在一个优选的实施方案中，本发明涉及对光合作用活性生物(特别是植物)中氮利用效率进行操作。具体地，本发明涉及在光合作用活性生物(特别是植物)中增强氮摄入和/或氮利用的方法。本发明还涉及在光合作用活性生物(特别是植物)中增强生物量产生(特别是在氮有限的条件下)的方法。
[0027]具体地， 本发明涉及适于在氮缺乏条件下生长的植物细胞和/或植物，以及在氮缺乏条件下显示提高的产量的植物细胞和/或植物。
[0028]本发明还涉及用于产生及筛选及培育这些植物细胞和/或植物的方法。[0029]植物营养对于植物的生长和发育而言是关键性的，因此对于植物产品的数量和质量来说也是关键性的。由于营养摄入和营养利用的效率对植物产量和产品品质有很大影响，所以在土壤中使用大量肥料来优化植物的生长和品质。
[0030]植物生长主要受限于三种养分一磷、钾和氮。因此，氮(N)是植物生长所需的主要营养元素之一，通常是植物生长的限速元素。氮是可见于活细胞中的大量重要化合物(如氨基酸、蛋白质(如酶)、核酸和叶绿素)的一部分。植物干物质的1.5%至2%和植物总蛋白的约16%是氮。因此，氮的利用度对氨基酸合成和氨基酸组成、氨基酸累积、蛋白质合成及累积有重大影响，因此是植物生长和产量的重要限制因素(Frink C.R., Proc.Natl.AcadSc1.USA96, 1175(1999))。
[0031]植物可利用多种氮种类，包括氨气(NH3)、氮氧化物(NOx)、矿物氮(如硝酸盐(NO3O和铵盐(NH4+))、尿素及尿素衍生物以及有机氮(氨基酸、肽等)。一些植物能通过共生细菌或某些真菌利用大气中的氮。然而，在多数农业土壤中，硝酸盐(N03_)是最重要的氮源(Crawford N.M., Glass A.D.M., Trends in Plant Science, 3389(1998) ; HirschR.E.，Sussman M.R.，TIBTechl7, 356(1999))。尽管如此，铵NH4+也发挥重要的(也许是被低估的)作用，因此多数植物在两种形式均存在时偏好摄入NH4+,甚至在NH4+的存在浓度低于NOf 时也是这样(von Wiren N.等，Curr.0pin.Plant Biol.3, 254 (2000)) ?
[0032]由于作物植物的高氮需求，氮肥是十分广泛的农业投资，每年施用八千万吨氮肥(硝酸盐和 / 或铵)(Frink C.R., Proc.Natl.Acad Sc1.USA96, 1175 (1999))。在作物生产中大量使用含氮肥料也有不良的环境后果，因为作物仅保留所施用氮的约三分之二。因此，大量的肥料投入通过淋洗、气体丧失和作物清除而导致了大量输出。接着未吸收的氮可被淋洗到土壤中并污染水源(Frink C.R., Proc.Natl.Acad Sc1.USA96, 1175 (1999))。由于大量氮从农业生态系淋洗到地表水和地下水中，氮也被认为是一种污染物。氮淋洗(即作为硝酸盐从农业田地中淋洗出来)影响饮用水的品质，并导致湖泊和海岸地区的富营养化。大量使用含氮肥料可进一步导致土壤品`质最终恶化、环境污染和卫生危险。
[0033]由于对于农业产品收入而言每年的高氮肥费用及其对环境的有害影响，期望开发出这样的方法，以减少氮肥投入和/或优化氮摄入和/或对给定氮利用度的利用，而同时维持光合作用活性生物(优选栽培植物，如作物)的最佳产量、生产力和品质。还期望获得“现有”的作物产量而同时肥料投入更少和/或在类似或甚至更贫瘠的土壤上具有更高的产量。
[0034]对于高效的氮摄入和利用而言，需要涉及氮的吸收、转运、同化和再分布的复杂过程来有效运行。不同研究人员已经在一些物种中证明了基因型之间氮吸收的差异(Chang
S.C.,Robison D.J., Sc1.World J.，Suppl.2，407 (2001))。还在小麦和芸苔中报道了氮摄入的基因型差异的可观证据(Weisler 等,Sc1.World J., Suppl.2, 61 (2001) ;Gallais
A., Hirel B., J.Exper.Bot.55, 295 (2004))。
[0035]植物通过位于根表皮的转运蛋白和皮层细胞质膜从宽硝酸盐浓度范围中吸收硝酸盐，其中利用了数种不同转运机制，包括组成型及硝酸盐诱导型高亲和力转运系统以及硝酸盐诱导型低亲和力转运蛋白(Stitt M., Curr.0pin.Plant Biol.2，178 (1999))。此外,植物中的硝酸盐摄入收到其他转运及代谢途径的高度调控和协同(Crawford N.M.PlantCell7, 859(1995)),已经鉴定和表征了大量硝酸盐摄入及同化相关的基因(Forde
B.G., Ann.Rev.Plant Biol53，203 (2002))。一旦进入根细胞胞质之后，硝酸盐可以存储在液泡中供以后使用、转运到木质部并转移至嫩枝用于同化和/或存储、释放回根际中或者通过硝酸盐还原酶(NR)和亚硝酸盐还原酶(NiR)还原成亚硝酸盐并接着还原成氨。硝酸盐还原成亚硝酸盐并接着还原成氨使得氮通过GOGAT途径被同化进氨基酸中(StittΜ.，Curr.0pin.Plant Biol.2, 178(1999))。为了掺入氨基酸、核酸及其他化合物中，N03_必须被还原成NH4+。NR (硝酸盐还原酶)是NOf还原成NH4+的过程中的第一种酶。它是底物诱导型的酶，并被认为是氮同化中最限制速度的步骤。[0036]N03_还原的原位速率主要受N03_摄入速率的控制，而不是硝酸盐还原酶活性(NRA)的改变或还原力限制的控制。因此，no3_摄入看来在no3_喂饲植物的氮同化中是最重要的。NRA的遗传改变已在若干物种中充分证实。NRA受到诸如以下的因素的影响:环境条件和植物发育阶段以及植物部分(如根和顶部)。此外，体内和体外测定通常给出不同的结果。在若干研究者将NRA与谷粒产量及N相关性状(如总还原植物氮、谷粒氮含量、谷粒氮浓度和氮收获指数)相关联的尝试中获得了不同的结果。
[0037]除了 N03_以外，植物还能摄入铵形式的氮。尽管土壤中的平均NH4+浓度经常比 NOf 的浓度低 10 至 1000 倍(Marschner H.L., “Mineral Nutrition in HigherPlants” , London, Academic Press, 1995),但土壤浓度的差异不必然反映各种氮源的摄入比例。当两种形式(N03_和NH4+)均可用时，植物偏好摄入NH4+,可能是因为其同化需要的能量更少，因为NO3-在同化之前必须先被还原(Bloom等，Plant Phys.1294-1301(1992))。
[0038]已经在不同生物(包括酵母和植物)中表征了铵摄入系统。酿酒酵母含有用于铵转运蛋白的三个MEP基因，它们均受氮控制，在存在易于代谢的氮源(如NH4+)时被抑制(Marini等，Mol.Cell Biol.17,4282(1997))。已经通过酵母突变体的互补、数据库同源性检索和异源杂交克隆了编码铵转运系统的植物基因(von Wiren N.等，Curr.0pin.PlantBiol.，3，254(2000))。NH4+转运蛋白生理功能的实验性证据主要依赖于铵转运蛋白表达与标记的铵的内向通量之间的相关性。在拟南芥和其他植物中，铵转运蛋白以基因家族存在，其成员具有不同的表达模式和生理特征，这一事实使得情况变得复杂。DE4337597要求保护植物铵转运蛋白的序列及其用于在某些情况下对氮代谢和植物生长进行操作的用途，但并没有通过异位表达植物铵转运蛋白获得的在某些条件下对氮同化或植物生长的正影响的任何证据。
[0039]无机氮同化成有机形式的第一步通常包括谷氨酰胺合酶催化的谷氨酸与氨形成谷氨酰胺的反应。因此，所形成的谷氨酰胺可进而将酰氨基中的氨官能团转移至天冬氨酸而形成天冬酰胺，由天冬酰胺合酶催化。氮从氨向天冬酰胺的稳定流动依赖于谷氨酸、α -酮戊二酸和天冬氨酸之间的循环，由谷氨酰胺-2-酮戊二酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶催化。谷氨酰胺和天冬酰胺代表了植物中主要的长距离“氮转运化合物”。它们在韧皮部树液中很丰富，但它们在植物氮代谢中却具有一些不同的作用，因为谷氨酰胺更具代谢活性，这是基于以下事实，它可直接将其酰氨基中的氨官能团转移至多种底物上，而天冬酰胺在“氮转运和存储”中更有效。
[0040]已知有不同的方法来描述光合作用生物中氮完整途径的效率——从氮从土壤中摄入开始、同化、含氮化合物的转运和累积、对生物量和产量的影响。鉴于优化氮利用的重要性，已进行了不同的策略来进行植物优化。
[0041]在一些情况下，氮同化途径中的酶(如谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶和天冬酰胺酶)被过表达。尽管开始并不成功，像在莲花中过表达胞质谷氨酰胺合成酶(Vincent R.等，Planta201，424 (1997))，但最近的文献显示了至少在一定程度上的成功。W095/09911描述了在转基因植物中过表达谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶和天冬酰胺酶，以用于增强氮固定和提高产量。Chichkova等在J.Exp.Bot.，52，2079 (2001)中报道，过表达苜蓿NADH-谷氨酸合酶的转基因烟草具有更高的碳和氮含量，但氮与碳相比并未特别富集。在另一情形中，氮同化基因的过表达(在这一情形中为大肠杆菌谷氨酸脱氢酶)未导致氮含量的相对提高，而是导致鲜重和干重显著提高。在另一情形中，ASNl基因的过表达增强了拟南芥种子中的氮状态(Lam H.等，Plant Physiol.321，926 (2003))。在这些过表达品系的种子中，作者观察到可溶性种子蛋白质含量的提高、酸水解种子中总蛋白含量的提闻以及幼苗在氣有限条件下生长时耐性的提闻。
[0042]Yanagisawa等，PNAS101，7833 (2004)实施了另一种有趣的方法。该作者使用转录因子Dofl。该调节因子的过表达诱导了转基因拟南芥中编码碳骨架产生之基因的上调、氨基酸含量显著提高以及葡萄糖含量减少。元素分析显示，转基因植物中的氮含量提高(约30%)，表明对氮净同化的促进。更重要的是，Dofl转基因植物显示出在低氮条件下改善的生长。尽管看起来很有前景，但该方法很可能具有这样的缺点，即其依赖于植物转录因子和复杂的相应信号级联，它们都是不同内部调节及反馈机制的对象，这至少在某些情况下改变或甚至消除了期望的效果。
[0043]因此，仍需要这样的光合作用活性生物(特别是植物)，其能够更有效地利用氮，从而获得与目前的氮利用水平下相同的产量或更高的产量所需的氮更少。此外，仍需要显示提高的生物量和/或产量的 光合作用活性生物，特别是植物。
[0044]因此，本发明的一个目的是开发在光合作用生物中增强氮摄入和/或转运和/或同化和/或利用(其单独或共同反映为提高的氮利用效率(NUE))的廉价方法和/或提高在氮供应有限的条件下的生物量产生和/或产量的方法。
[0045]我们发现，这一目的通过提供本文所述的方法而得以实现。
[0046]本发明的另一个目的是提供与相应的未转化野生型植物细胞和/或植物相比，显示增强的NUE和/或在氮供应有限条件下显示提高的生物量产生和/或产量的植物细胞和/或植物。
[0047]我们发现，这一目的通过提供本文所述发明的植物细胞和/或植物而得以实现。
[0048]在本发明的一个实施方案中，这些性状通过在光合作用活性生物(优选植物)中与相应未转化野生型光合作用活性生物相比增强氮利用(=氮利用效率(NUE))的方法来获得。
[0049]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，在正常条件下或低营养条件下显示出总体增强的产量(如上文所定义)，尤其是增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)生物量产量。
[0050]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)干生物量产量。
[0051]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地上干生物量产量。
[0052]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地下干生物量产量。
[0053]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)鲜重生物量产量。
[0054]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地上鲜重生物量产量。
[0055]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地下鲜重生物量产量。
[0056]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物可收获部分产量。
[0057]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物干可收获部分产量。
[0058]在其一个实施方案中`，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物干地上可收获部分产量。
[0059]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物干地下可收获部分产量。
[0060]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物可收获部分鲜重产量。
[0061]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物地上可收获部分鲜重产量。
[0062]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物地下可收获部分鲜重产量。[0063]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)作物果实产量。
[0064]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)鲜作物果实产量。
[0065]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)干作物果实产量。
[0066]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮谷粒干重，类似于Reynolds, Μ.P., Ortiz-Monasterio J.J.和 McNab A.(eds.), 2001, “Application ofPhysiology in Whaet Breeding, Mexico, D.F.:CIMMYT,其通过引用并入本文。
[0067]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)种子产量。
[0068]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)种子鲜重产量。
[0069]在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出增强的每单位氮(来自该光合作用活性生物(优选植物)所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)种子干重产量。
[0070]在本发明的另一实施方案中，这些性状通过与相应未转化野生型光合作用活性生物相比，在光合作用活性生物(优选植物)中提高在氮供应有限条件下的生物量产生和/或产量的方法来实现。
[0071]在其一个实施方案中，术语“提高的生物量产生”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应的野生型光合作用活性生物相比，显示出在氮供应有限条件下提高的生长速率。提高的生长速率可反映为提高的完整植物生物量产生，或者提高的植物地上部分生物量产生，或者提高的植物地下部分生物量产生，或者提高的植物部分(如茎、叶、花、果实、种子)生物量产生。
[0072]在其一个实施方案中，提高的生物量包括更高的果实产量、更高的种子产量、更高的鲜物质产生和/或更高的干物质产生。
[0073]在另一实施方案中，术语“提高的生物量产生”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应未转化野生型光合作用活性生物相比，显示出在氮供应有限条件下延长的生长。延长的生长包括在未转化野生型光合作用活性生物显示可见的缺乏症状和/或死亡时，该光合作用活性生物(优选植物)存活和/或继续生长。 [0074]在本发明的一个实施方案中，根据以下方法对增强的NUE进行测定和定量:
[0075]在培养室(Svalof ffeibull, Svalov , Sweden)中的盆中培养转化植物。在植物为拟南芥的情况下，将其种子种在盆中，其中含有营养缺乏土((“Einheitserde TypO”, 30%粘土，Tantau，Wansdorf Germany))和沙子的1:1 (v: v)混合物。通过黑暗中4*?下的4天时间来诱导萌发。随后植物生长在标准生长条件下。在植物为拟南芥的情况下，标准培养条件为:16小时光照和8小时黑暗的光周期、20°C、60%相对湿度、200 μ E/m2S的光子通量密度。培养并栽培植物。在植物为拟南芥的情况下，每隔一天用N缺乏营养液浇水。N缺乏营养液例如在水中含有以下矿物养分，但不含其他含氮的盐:
[0076]
【权利要求】
1.产生与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量、特别是增强的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量产生的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其通过提高或产生选自以下的一种或多种活性来实现:3_酮固醇还原酶、60S核糖体蛋白、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、腺苷酸激酶、烷基氢过氧化物还原酶、烷基/芳基硫酸酯酶、α -葡糖苷酶、α -甘露糖苷酶、分裂后期促进复合物(APC)亚基、抗病毒衔接蛋白、芳族氨基酸氨基转移酶I1、ARVl蛋白、自吞噬特异性磷脂酰肌醇-3激酶复合体蛋白亚基、b0017-蛋白、B0165-蛋白、B1258-蛋白、B1267-蛋白、B1381-蛋白、bl933_ 蛋白、b2165_ 蛋白、b2238-蛋白、b2431-蛋白、B2646-蛋白、b2766_蛋白、b3120_蛋白、肉碱乙酰基转移酶、细胞壁内-1，3-葡聚糖酶、分子伴侣、几丁质合酶3复合体蛋白、磷酸胆碱胞苷酰转移酶、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶(双功能)、网格蛋白相关蛋白复合体小亚基、RAM信号网络的组分、半胱氨酸转运蛋白、细胞色素c氧化酶亚基VII1、胞质溶胶过氧化氢酶、胞质溶胶丝氨酸羟甲基转移酶、二氢乳清酸脱氢酶、二氢神经鞘氨醇磷酸酯裂合酶、核糖核酸外切酶、F1F0ATP合酶β亚基、因子停滞蛋白、G蛋白偶联外激素受体受体、Y-谷氨酰激酶、葡糖淀粉酶、甘油-3-磷酸转运蛋白亚基、甘氨酸脱羧酶、糖基转移酶、高尔基体膜交换因子亚基、高尔基体膜蛋白、GP1-锚着细胞壁蛋白、GTP结合蛋白、与肌醇/胆碱应答元件结合的螺旋-环-螺旋转录激活子、己糖转运蛋白、调节渗透感受MAP激酶级联的组氨酸激酶渗透感受器、水解酶、羟胺还原酶、羟基十四酰酰基载体蛋白脱水酶、过氧化物酶体遗传蛋白、定位于晚期高尔基泡的膜内在蛋白、铁硫簇装配蛋白、异构酶、赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基、赖氨酸特异性金属蛋白酶、溶血磷脂酶、Mcmlp结合转录阻抑物、减数分裂重组蛋白、膜蛋白、金属离子转运蛋白、微粒体β_酮还原酶、线粒体内膜间隙蛋白、线粒体蛋白、线粒体核糖体蛋白大亚基、线粒体核糖体蛋白小亚基、线粒体丝氨酰-tRNA合成酶、钥喋呤生物合成蛋白、肌醇转 运蛋白、非必需动粒蛋白、非必需Ras鸟苷酸交换因子、Ras样蛋白Rho/Rac亚家族的非必需小GTP酶、核帽结合蛋白复合体亚基、核融合蛋白前体、核孔复合体亚基、起点识别复合体亚基、外膜引导蛋白、氧化还原酶、肽转运蛋白、肽酰-脯氨酰顺反异构酶、PhoH-样蛋白、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、葡糖磷酸变位酶/磷酸甘露糖变位酶、磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、钾:氢反向转运蛋白、脯氨酸脱氢酶、核糖体大亚基的蛋白质组分、参与shmoo形成和双极出芽位点选择的蛋白质、参与鞘脂生物合成的蛋白质、蛋白激酶、含有L-A双链RNA的微粒的结构稳定性所必需的蛋白质、核糖体RNA成熟所需的蛋白质、蛋白质移位酶蛋白、调节性CAT8蛋白、Glc7pl型蛋白丝氨酸-苏氨酸磷酸酶的调节性亚基、26S蛋白酶体的调节性亚基、Gl转录的阻抑物、Rho GDP-解离抑制子、核糖核蛋白、核糖体蛋白小亚基、RNA聚合酶III亚基、酵母氨酸脱氢酶、短链脂肪酸转运蛋白、信号识别颗粒亚基(SRP54)、信号转导MEK激酶、用于mRNA剪接的SM复合体B蛋白、纺锤体检查点复合体亚基、剪接因子、稳定期蛋白、胞质苯丙氨酰-tRNA合成酶亚基、顺面高尔基体转运蛋白颗粒(TRAPP)复合体亚基、苏氨酸脱氨酶、转录延伸因子、转录因子、转录激活子、翻译延伸因子EF-3(HEF3)、在细胞壁多聚体组成中发挥作用的跨膜蛋白、转运蛋白、泛素调节蛋白、UDP-N-乙酰基-葡糖胺-1-P转移酶、v-SNARE结合蛋白、参与高尔基体转运的v-SNARE蛋白、木糖醇脱氢酶、yal019w蛋白、ybr262c蛋白、YDR070C蛋白、ydr355c蛋白、YFR007W 蛋白、ygrl22c-a 蛋白、ygr266w 蛋白、ygr290w 蛋白、YHL005C 蛋白、yhl021c蛋白、yhrl27w 蛋白、YJL010C 蛋白、yjl064w 蛋白、yjl067w 蛋白、yjl213w 蛋白、ykllOOc 蛋白、YKLlIIC 蛋白、ykll31w 蛋白、ykr016w 蛋白、ykr021w 蛋白、yll014w 蛋白、y11023c 蛋白、yll037w 蛋白、yll049w 蛋白、ylr042c 蛋白、YLR053C 蛋白、ylr065c 蛋白、ylrl25w 蛋白、ylr404w 蛋白、ylr463c 蛋白、yml089c 蛋白、YML101C 蛋白、ymll28c 蛋白、YMR082C 蛋白、YMR126C 膜蛋白、YMR144W 蛋白、YMR160W 蛋白、YMR209C 蛋白、YMR233W 蛋白、YNL320W 蛋白、Y0R097C蛋白、Y0R203W蛋白、YPL068C蛋白、锌指蛋白和锌金属蛋白酶。
2.产生与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量、特别是增强的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量产生的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其通过提高或产生至少一种多肽的活性来实现，所述多肽包含选自以下的多肽: (i)分别包含表1I或表1V第5或7列所示多肽、共有序列或至少一种多肽基序的多肽；或 (ii)包含表1第5或7列所不多核苷酸之核酸分子的表达产物；或 (iii)(i)或(ii)的功能等同物。
3.产生与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量、特别是增强的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量产生的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其通过提高或产生至少一种核酸分子的 ⑴表达;和/或 (ii)表达产物的表达；和/或 (iii)所编码的表达产物的活性 来实现，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子: Ca)编码表1I第5或7列所示多肽的核酸分子； (b)表1第5或7列所示核酸分子； (c)核酸分子，其可由于遗传密码的简并性而衍生自表1I第5或7列所示多肽序列，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提闻的生物量广生； (d)核酸分子,其与包含表1第5或7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%同一性，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生； (e)核酸分子，其编码与(a)至(C)所述核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性的多肽，并具有包含表1第5列所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生。
4.权利要求1的方法，其中所述提高的产量、特别是增强的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量产生通过提高或产生包含权利要求2所述多肽之至少一种多肽的活性来赋予，和/或通过提高或产生包含权利要求3所述核酸分子的至少一种核酸分子的活性来赋予。
5.权利要求2的方法，其中所述提高的产量、特别是增强的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量产生通过提高或产生包含权利要求3所述核酸分子的至少一种核酸分子的活性来赋予。
6.产生与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量、特别是增强的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量产生的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其通过用核酸分子转化植物细胞或植物细胞核或植物组织并且从所转化的植物细胞核、植物细胞或植物组织再生具有提高的产量的转基因植物来实现，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子: Ca)编码表1I第5或7列所示多肽的核酸分子； (b)表1第5或7列所示的核酸分子； (c)核酸分子，其可由于遗传密码的简并性而衍生自表1I第5或7列所示多肽序列，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提闻的生物量广生； (d)核酸分子,其与包含表1第5或7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%同一性，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生； (e)核酸分子，其编码与(a)至(C)所述核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性的多肽，并具有包含表1第5列所述多核苷酸的核酸分子的活性，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其导致与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比在标准生长条件下具有提高的产量。
8.分尚的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子: Ca)编码表1I B第5或7列所示多肽的核酸分子；` (b)表1B第5或7列所示的核酸分子； (c)核酸分子，其可由于遗传密码的简并性而衍生自表1I第5或7列所示多肽序列，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提闻的生物量广生； (d)核酸分子,其与包含表1第5或7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%同一性，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生； (e)核酸分子，其编码与(a)至(C)所述核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性的多肽，并具有包含表1第5列所述多核苷酸的核酸分子的活性，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生； (f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)至(C)的核酸分子杂交，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生； (g)核酸分子，其编码可借助于针对表(a)至(e)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆或多克隆抗体来分离的多肽，并具有包含表1第5列所示多核苷酸的核酸分子代表的活性； (h)核酸分子，其编码包含表1V第7列所示共有序列或者一种或多种多肽基序的多肽，并优选具有包含表1I或IV第5列所示多核苷酸的核酸分子代表的活性； (i)核酸分子，其编码具有表1I第5列所示蛋白质之活性的多肽，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生； (j)核酸分子，其包含通过用表1II第7列所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得的多核苷酸，并优选具有包含表1I或IV第5列所不多核苷酸的核酸分子代表的活性； 和 (k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库而获得，其中使用包含(a)或(b)之核酸分子的互补序列的探针，或者使用其片段，所述探针或片段具有与(a)至Ce)所表征核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并编码多肽，所述多肽具有包含表1I第5列所示多肽的蛋白质的活性。
9.核酸分子，其在表1A第5或7列所不序列的至少一个或多个核苷酸中与权利要求8所述核酸分子不同，并优选编码与表1IA第5或7列所示蛋白质序列存在至少一个或多个氨基酸差异的蛋白质。
10.核酸构建体，其赋予权利要求8或9所述核酸分子或者权利要求6所述核酸分子的表达，包含一个或多个调节元件，特别是其中所述核酸在宿主细胞中的表达导致与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生。
11.载体，其包含权利要求8或9所述核酸分子或者权利要求6所述核酸分子或者权利要求10所述核酸构建体，特别是所述编码核酸在宿主细胞中的表达导致与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生。
12.宿主细胞，其已经稳定或瞬时转化了权利要求11所述载体或者权利要求8或9所述核酸分子或者权利要求6所述核酸分子或者权利要求10所述核酸构建体，特别是由于所述转化而显示出与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生。
13.用于产生多肽的方法，其中所述多肽在权利要求12所述宿主细胞中表达。
14.多肽，其通过权利要求13的方法产生，或者由权利要求8或9所述核酸分子编码，或者由权利要求6所述核酸分子编码，其中所述多肽与表1IA所示序列存在一个或多个氨基酸的差异，特别是如表1IB所不。
15.与权利要求14所述多肽特异性结合的抗体。
16.转基因植物细胞核、植物细胞、植物组织、繁殖材料、收获材料、植物或其部分，其包含权利要求8或9所述核酸分子或者权利要求6所述核酸分子或者权利要求12所述宿主细胞。
17.再生植物后得到的转基因植物细胞核、植物细胞、植物组织、繁殖材料、收获材料或植物部分，所述植物与相应未转化野生型相比具有提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生，或者与相应未转化野生型相比具有提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生的转基因植物，其通过权利要求1至7的方法产生，或者转化了权利要求8或9所述核酸分子或者权利要求6所述核酸分子或者权利要求10所述核酸构建体。
18.权利要求17的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自单子叶植物。
19.权利要求17的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自双子叶植物。
20.权利要求17的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽，包括芸苔和冬季油菜、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、萝卜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、西红柿、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本植物、饲料作物和拟南芥。
21.权利要求17的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和水稻。
22.由权利要求16至21中任一项的转基因植物产生的种子，其中所述种子对于赋予与相应未转化野生型相比提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生的转基因而目是基因纯合的。
23.用于鉴定在转基因植物细胞、植物或其部分中赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生的化合物的方法，包括以下步骤: (a)培养转基因植物细胞、植物或其部分或者维持转基因植物，其表达权利要求8或9之核酸分子编码或者由权利要求6之核酸分子编码的多肽，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分、任选地未转化野生型植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生；以及读数系统，其能在合适条件下与多肽相互作用，所述条件允许该多肽与所述读数系统在化合物或含有多种化合物之样品存在下相互作用，并且其能够应答于化合物与所述多肽在允许表达所述读数系统及多肽的条件下的结合而提供可检测的信号，所述多肽由权利要求8或9的核酸分子编码，或者由权利要求6所述核酸分子编码，并赋予与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分、未转化野生型植物或其部分相比提高的产量，特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生；` (b)通过检测所述读数系统所产生信号的存在与否或提高来鉴定化合物是否是有效的激动剂。
24.用于产生农用组合物的方法，其包括权利要求23的步骤以及将权利要求23所鉴定化合物配制成可农业应用可接受的形式。
25.组合物，其包含权利要求8或9中任一项所述核酸分子或者权利要求6所述核酸分子、权利要求14所述多肽、权利要求2所述多肽、权利要求10所述核酸构建体、权利要求11所述载体、权利要求24所述化合物和/或权利要求15所述抗体，并任选地包含可农用载体。
26.权利要求14所述分离的多肽，特别是表11、优选表1IB所示多肽，并且其选自酵母、优选酿酒酵母，或选自大肠杆菌。
27.产生与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生通过表达权利要求14之核酸所编码多肽来提高，或者通过表达权利要求2所述多肽来提高，并导致与相应未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生，该方法包括: (a)用权利要求11的表达载体或者包含权利要求6所述核酸分子的表达载体转化植物细胞或植物的部分，和(b)从所述植物细胞或植物的部分产生与相应未转化野生型植物相比具有提高的产量、特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生的转基因植物。
【文档编号】C12N9/00GK103695459SQ201310645800
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2008年9月17日 优先权日:2007年9月18日
【发明者】P·普齐奥, O·布莱辛, O·蒂姆, G·里特, H·舍恩 申请人:巴斯夫植物科学有限公司