体外腭器官三维培养方法
【专利摘要】本发明公开一种体外腭器官三维培养方法，是取胚胎腭发育前期或发育期眶下缘至口角部的全部组织，包埋在水凝胶支架中；添加培养液进行三维培养。可提供近似体内的三维生长环境，避免使用昂贵材料和工艺，具有操作简单、成本低等优点，此外，通过改变水凝胶支架的组成可调控腭板组织的生物学特性，适合胚胎发育不同时期的正常及异常腭板组织培养，可用于腭裂形成机制研究及促腭板形成药物的筛选。
【专利说明】体外腭器官三维培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞、分子生物学等领域，尤其是一种可实现腭板组织长期高活性的体外腭器官三维培养方法。
【背景技术】
[0002]唇腭裂是新生儿中较为常见的发育畸形，而腭裂的动物又难于在出生后存活，为了研究腭板的发育过程以及腭板融合的机理，腭板组织的体外培养是十分必要的。目前，腭板组织体外培养方法只有静态培养和动态培养两种:静态培养方法是将腭板放置于多孔膜上，并添加培养基进行静态培养；动态培养方法是在培养液流动状态下进行悬浮培养。但是，无论是哪种培养方法，目前腭板在体外的最长的培养时间仅为80小时。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可实现腭板组织长期高活性的体外腭器官三维培养方法。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种体外腭器官三维培养方法，是取胚胎腭发育前期或发育期眶下缘至口角部的全部组织，包埋在水凝胶支架中；添加培养液进行三维培养。
[0005]所述胚胎是啮齿类、卵生类、鱼类、哺乳类动物的胚胎。
[0006]所述胚胎是药物诱导腭裂动物、基因敲除腭裂动物或自发性腭裂动物的胚胎。
[0007]所述胚胎组织的发育时间为4~8天。
[0008]所述水凝胶支架为Matrigel基质胶支架、胶原水凝胶支架、透明透明质酸/胶原复合水凝胶支架或海藻酸盐水凝胶支架。
[0009]所述Matrigel基质胶是稀释倍数等于I的被稀释Matrigel基质胶。
[0010]所述胶原水凝胶为I型、II型胶原的至少一种，分子量为3(T1000kDa，浓度为10mg/ml。
[0011]所述透明透明质酸/胶原复合水凝胶是氧化透明质酸与胶原反应形成的复合水凝胶。
[0012]所述海藻酸盐水凝胶支架包括块状以及直径为0.1~δαιι的微球，由海藻酸钠溶液与钙、钡、锌二价阳离子溶液固化所形成；浓度为0.3-4% (w/v);钙、钡、锌二价阳离子溶液浓度为5~200mM ;固化时间5-40min。
[0013]所述海藻酸盐水凝胶是海藻酸钠与精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠的混合物。
[0014]本发明利用水凝胶作为腭板组织(上颚、鼻中隔下部与周围组织)培养的三维支架，可提供近似体内的三维生长环境，避免使用昂贵材料和工艺，具有操作简单、成本低等优点，此外，通过改变水凝胶支架的组成可调控腭板组织的生物学特性，适合胚胎发育不同时期的正常及异常腭板组织培养，可用于腭裂形成机制研究及促腭板形成药物的筛选。【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例1培养正常小鼠腭板组织的样本明场及HE染色照片。
[0016]图2为本发明实施例1稀释1倍及2倍Matrigel基质胶三维培养正常小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图。
[0017]图3为本发明实施例1稀释1倍及2倍Matrigel基质胶三维培养正常小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图。
[0018]图4为本发明实施例1稀释1倍及2倍Matrigel基质胶三维培养正常小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图。
[0019]图5为本发明实施例2中5mg/ml及10mg/ml胶原水凝胶三维培养自发性腭裂小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图。
[0020]图6为本发明实施例2中5mg/ml及10mg/ml胶原水凝胶三维培养自发性腭裂小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图。
[0021]图7为本发明实施例2中5mg/ml及10mg/ml胶原水凝胶三维培养自发性腭裂小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图。
[0022]图8为本发明实施例3低含量及高含量氧化透明质酸HA三维培养药物诱导腭裂小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图。
[0023]图9为本发明实施例3低含量及高含量氧化透明质酸HA三维培养药物诱导腭裂小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图。
[0024]图10为本发明实施例3低含量及高含量氧化透明质酸HA三维培养药物诱导腭裂小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图。
[0025]图11为本发明实施例4未修饰ALG以及RGD修饰ALG三维培养维甲酸(RA)处理小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图。
[0026]图12为本发明实施例4未修饰ALG以及RGD修饰ALG三维培养维甲酸(RA)处理小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图。
[0027]图13为为本发明实施例4未修饰ALG以及RGD修饰ALG三维培养维甲酸(RA)处理小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图。
【具体实施方式】
[0028]实施例1:Matrigel基质胶体外三维培养腭板组织
分离正常小鼠胚胎腭发育期(胚胎期第5天)的面中三分之一组织(取眶下缘至口角部的全部组织，包括上颚、鼻中隔下部与周围组织，简称腭器官)之后分别与无血清DMEM稀释I倍、2倍的Matrigel基质胶混合，每组10个样本，放置在培养箱中固化成胶。I小时后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养。以未包埋的小鼠腭板组织作为实验对照组(10个样本)。各组均体外培养6天，每两天更换新鲜培养液。6天后，观察各组的腭板组织，统计具有正常腭板组织结构，发生双侧腭板扩展以及融合的样本数，测量并统计双侧腭板间缝隙面积。另外，将腭板组织置于4%多聚甲醛中固定后制备组织切片，进行TUNEL以及HE染色，统计凋亡细胞密度。
[0029]三维培养正常小鼠腭板组织的样本明场以及HE染色照片(培养6天，Bar 200 μ m)如图1所示:图1A为对照组明场照片；图1B为对照组HE染色照片；图1C为稀释1倍Matrigel基质胶组明场照片；图1D为稀释I倍Matrigel基质胶组HE染色照片。
[0030]三维培养正常小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图如图2所示。
[0031]三维培养正常小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图如图3所示。
[0032]三维培养正常小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图如图4所示。
[0033]实验结果显示，与无支架包埋的正常小鼠腭板组织对照组相比，Matrigel基质胶培养组发生了双侧腭板融合(图1与2)，促进了双侧腭板扩展(图2)，明显减小了双侧腭板间缝隙面积(图3)，显著降低了凋亡细胞密度(图4)。另外，还发现稀释I倍的Matrigel基质胶与稀释2倍相比，发生融合的样本数进一步提高，间缝隙面积进一步降低，凋亡细胞密度明显下降。上述实验结果说明，利用Matrigel基质胶可实现腭板组织的长期高活性体外培养，并且降低Matrigel基质胶的稀释倍数能进一步促进腭板组织扩展、融合和提高细胞活性。
[0034]实施例2:胶原水凝胶体外三维培养腭板组织
分离自发性腭裂小鼠胚胎腭发育期(胚胎期第6天)的面中三分之一组织(取眶下缘至口角部的全部组织，包括上颚、鼻中隔下部与周围组织，简称腭器官)，之后分别与浓度为5mg/ml以及10mg/ml的鼠II型胶原(分子量500kDa)溶液混合,每组10个样本，置培养箱中固化40min，形成直径2cm，厚度Icm的圆柱形水凝胶，并添加含有10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养。以未包埋的自发性腭裂小鼠腭板组织作为实验对照组(10个样本)。各组均体外培养6天，每两天更换新鲜培养液。6天后，观察各组的腭板组织，统计具有正常腭板组织结构，发生双侧腭板扩展以及融合的样本数，测量并统计双侧腭板间缝隙面积。另外，将腭板组织置于4% 多聚甲醛中固定后制备组织切片，进行TUNEL以及HE染色，统计凋亡细胞密度。
[0035]三维培养自发性腭裂小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图如图5所示。
[0036]三维培养自发性腭裂小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图如图6所示。
[0037]三维培养自发性腭裂小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图如图7所示。
[0038]实验结果显示，与无支架包埋自发性腭裂小鼠腭板组织对照组相比，胶原水凝胶培养较好地保持了腭板组织的结构，促进了双侧腭板扩展(图5)，双侧腭板间缝隙面积明显减小(图6)，凋亡细胞密度明显降低(图7)。另外还发现，10mg/ml的胶原凝胶与5mg/ml相比，腭板组织结构维持、双侧腭板扩展得到了进一步提高，双侧腭板间缝隙面积进一步降低，凋亡细胞密度明显下降。这些实验结果说明，利用胶原水凝胶可实现腭板组织的长期高活性体外培养，并且提高胶原浓度能促进自发性腭裂小鼠腭板组织的结构维持、双侧腭板的扩展及细胞活性的提高。
[0039]实施例3:氧化透明质酸/胶原复合水凝胶支架体外三维培养腭板组织
将牛透明质酸钠(分子量1100 kDa)配制成10 mg /ml的水溶液，按透明质酸钠/高碘酸钠体积比4:1加入20mM高碘酸钠溶液，25°C避光条件下搅拌反应5h，然后透析，最后进行冷冻干燥，获得氧化透明质酸。
[0040]配制0.9% (w/v)胶原溶液，并将此胶原溶液、DMEM培养基及NaOH-NaHCO3-1fepes缓冲液按照7:2:1 (v/v)比例混合，再将0.6% (w/v)氧化透明质酸水溶液按照10:1以及30:1 (v/v)(溶液:氧化透明质酸水溶液)混合，缓慢搅拌，将混合液置于4°C冰箱静置24h0
[0041]分离药物诱导腭裂小鼠胚胎腭发育期(胚胎期第5天)的面中三分之一组织(取眶下缘至口角部的全部组织，包括上颚、鼻中隔下部与周围组织，简称腭器官)，之后分别与上述两种混合液按1:1、1:3比例混合，分别为低含量及高含量氧化透明质酸HA，每组10个样本，置培养箱中固化20min，并添加含有10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养。以未包埋的基因敲除腭裂小鼠腭板组织作为实验对照组(10个样本)。各组均体外培养6天，每两天更换新鲜培养液。培养6天后，观察各组的腭板组织，统计具有正常腭板组织结构，发生双侧腭板扩展以及融合的样本数，测量并统计双侧腭板间缝隙面积。另外，将腭板组织置于4%多聚甲醛中固定后制备组织切片，进行TUNEL以及HE染色，统计凋亡细胞密度。
[0042]三维培养药物诱导腭裂小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图如图8所示。
[0043]三维培养药物诱导腭裂小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图如图9所
[0044]三维培养药物诱导腭裂小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图如图10所示。
[0045]结果显示，与无支架包埋的基因敲除腭裂小鼠腭板组织对照组相比，氧化透明质酸/胶原复合水凝胶支架较好地保持了腭板组织的结构，促进了双侧腭板扩展(图8)，双侧腭板间缝隙面积明显减小(图9)，凋亡细胞密度明显降低(图10)。另外还发现，含有较高浓度氧化透明质酸的水凝胶进一步维持了腭板组织结构，促进了双侧腭板扩展，缩小了双侧腭板间缝隙面积，下调了凋亡细胞的密度。这些实验结果说明，利用透明质酸水凝胶支架可实现腭板组织的长期高活性体外培养，并且改变透明质酸的浓度能调控腭板组织的相关生物学特性。
[0046]实施例4:海藻酸钙水凝胶支架体外三维培养腭板组织
首先，制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰的海藻酸钠。将海藻酸钠(分子量500kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比2)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸钠溶液。再加入1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和RGD多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为1:20，EDC和sulfo-NHS摩尔比为2:1, RGD多肽和海藻酸钠质量比为1:1000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到RGD修饰的海藻酸钠。
[0047]将RGD修饰以及未修饰的海藻酸钠粉末分别溶解于生理盐水中，得到1.5%(ff/V)的海藻酸钠溶液。
[0048]分离20个维甲酸(RA)处理小鼠胚胎腭发育期(胚胎期第5天)的面中三分之一组织(取眶下缘至口角部的全部组织，包括上颚、鼻中隔下部与周围组织，简称腭器官)小鼠的腭板组织(胚胎期第6天)，之后分别与上述两种海藻酸钠溶液混合，每组10个样本，再滴加到200 mmol.!/1 CaCl2溶液中，室温钙化30min，形成直径2cm的海藻酸钙凝胶微球。之后，使用含有10%胎牛血清的DMEM培养液洗涤3次，最后置于培养箱中进行静态培养6天，每两天更换培养液。以RA处理小鼠未包埋的腭板组织作为对照组(10个样本)。培养6天后，观察各组的腭板组织，统计具有正常腭板组织结构，发生双侧腭板扩展以及融合的样本数，测量并统计双侧腭板间缝隙面积。另外，将腭板组织置于4%多聚甲醛中固定后制备组织切片，进行TUNEL以及HE染色，统计凋亡细胞密度。
[0049]三维培养维甲酸(RA)处理小鼠腭板组织中维持组织结构、发生双侧腭板扩展以及融合的样本数统计图如图11所示。
[0050]三维培养维甲酸(RA)处理小鼠腭板组织中双侧腭板间缝隙面积的统计图如图12所示。
[0051]三维培养维甲酸(RA)处理小鼠腭板组织中凋亡细胞比例的统计图如图13所示。
[0052]实验结果显示，与无支架包埋RA处理小鼠的腭板组织对照组相比，海藻酸钙水凝胶支架较好地维持了腭板组织的正常结构，显著促进了双侧腭板扩展(图11)，减小了双侧腭板间缝隙面积(图12)，降低了凋亡细胞密度(图13)。另外，RGD修饰海藻酸钙水凝胶与未改性支架相比，RA处理腭板组织的扩展明显提高，双侧腭板间缝隙面积进一步降低，凋亡细胞密度明显下降。这些实验结果说明，利用海藻酸钙水凝胶支架可实现腭板组织的长期高活性体外 培养，并且生物功能化修饰对于腭板组织的生物学行为具有重要的调控作用。
【权利要求】
1.一种体外腭器官三维培养方法，其特征在于:取胚胎腭发育前期或发育期眶下缘至口角部的全部组织，包埋在水凝胶支架中；添加培养液进行三维培养。
2.根据权利要求1所述体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述胚胎是啮齿类、卵生类、鱼类、哺乳类动物的胚胎。
3.根据权利要求2所述体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述胚胎是药物诱导腭裂动物、基因敲除腭裂动物或自发性腭裂动物的胚胎。
4.根据权利要求1所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述胚胎组织的发育时间为4-8天。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述水凝胶支架为Matrigel基质胶支架、胶原水凝胶支架、透明质酸/胶原复合水凝胶支架或海藻酸盐水凝胶支架。
6.根据权利要求5所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述Matrigel基质胶是稀释倍数等于I的被稀释Matrigel基质胶。
7.根据权利要求5所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述胶原水凝胶为I型、II型胶原的至少一种，分子量为3(T1000kDa，浓度为10 mg/ml。
8.根据权利要求5所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述透明质酸/胶原复合水凝胶是氧化透明质酸与胶原反应形成的复合水凝胶。
9.根据权利要求5所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述海藻酸盐水凝胶支架包括块状以及直径为0.1-5cm的微球，由海藻酸钠溶液与钙、钡、锌二价阳离子溶液固化所形成；浓度为0.3~4% (w/v);钙、钡、锌二价阳离子溶液浓度为5~200mM ;固化时间5_40mino
10.根据权利要求9所述的体外腭器官三维培养方法，其特征在于:所述海藻酸盐水凝胶是海藻酸钠与精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠的混合物。
【文档编号】C12N5/073GK103849594SQ201310657627
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】肖晶, 孙广炜, 刘洋, 徐小溪, 李楠, 刘波, 丛蔚, 马小军 申请人:大连医科大学