一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，通过副溶血性弧菌阳性标本制备、副溶血性弧菌浓缩富集、副溶血性弧菌核酸提取、引物设计、模板制备、基因扩增和PCR产物分析等步骤完成。本发明实现了水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌鉴定方法，这种方法省时，省力，检测灵敏度高，能够很好满足人们对水产养殖鱼类等日益严格的质量要求，并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。
【专利说明】—种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产养殖领域，特别是涉及一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]水产养殖动物具有低脂肪、高蛋白的特点，肉质鲜美，膳食结构合理，深受广大消费者的青睐。但随着水产养殖环境的恶化，复杂的水体环境使水产养殖动物体内常会滋生一些致病性微生物，如果这些致病微生物残留，富集在水产养殖动物体内就会严重危害食用者的健康。
[0003]副溶血性弧菌是众多致病性微生物中较为常见的一种，它是一种嗜盐性细菌，主要来自海产养殖鱼类，存活能力强，海水中可存活47天。食物中毒一般表现为急发病，临床上以腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。
[0004]目前，使用传统的检测方法，即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但费力、耗时，一般需4一7 d才能完成，这对水产养殖及后期的加工处理是不现实的。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法来及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。
【发明内容】
[0005]本发明主要解 决的技术问题是提供一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，能够解决现有致病微生物检测方法存在的费时，费力，特异性不强的问题。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，检测步骤包括:
Cl)副溶血性弧菌阳性标本制备:取300~800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入lm3，含10条15~20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；
(2)副溶血性弧菌浓缩富集:分别取阳性标本和待测样本各4~5条，阳性标本和待测样本分别取20~100g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2~4°C下以5 000转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2~4°C静置2 h，以8 000转/分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬；
(3)副溶血性弧菌核酸提取:将步骤(2)中5~IOml溶液用凯杰DNA提取试剂盒提取
DNA ；
(4 )引物设计:上游弓丨物 AGACMCTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGMATAG ；
(5)模板制备:将步骤(3)中获得的提取液在_4°C下以4000转/分的转速离心，取沉淀，一定温度下放置15~30分钟；
(6)基因扩增:将步骤(5)中制备的模板放置于PCR扩增体系中进行基因扩增；
(7)PCR产物分析:将步骤(6)中的扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。
[0007]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(1)中副溶血性弧菌原液体积为600ml。
[0008]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(2)中标本和待测样本的鱼鳞分别为80mgo
[0009]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(3)中的溶液为10ml。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(5)中放置温度为25°C。
[0011]在本发明一个较佳实施例中，所述步骤(6)中PCR扩增体系为10 X PCR缓冲液2uL, Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超纯水5.4ul，模板lul。
[0012]本发明的有益效果是:本发明一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，实现了水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌鉴定方法，这种方法省时，省力，检测灵敏度高，能够很好满足人们对水产养殖鱼类等日益严格的质量要求。并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。
【具体实施方式】
[0013]下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0014]本发明实施例包括:
一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法,检测步骤包括:
Cl)副溶血性弧菌阳性标本制备:取300~800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入lm3，含10条15~20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；
(2)副溶血性弧菌浓缩富集:分别取阳性标本和待测样本各4~5条，阳性标本和待测样本分别取20~100g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2~4°C下以5 000转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2~4°C静置2 h，以8 000转/ 分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬；
(3)副溶血性弧菌核酸提取:将步骤(2)中5~IOml溶液用凯杰DNA提取试剂盒提取
DNA ；
(4 )引物设计:上游弓丨物 AGACMCTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGMATAG ；
(5)模板制备:将步骤(3)中获得的提取液在_4°C下以4000转/分的转速离心，取沉淀，一定温度下放置15~30分钟；
(6)基因扩增:将步骤(5)中制备的模板放置于PCR扩增体系中进行基因扩增；所述扩增体系为10 X PCR缓冲液2uL，Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超纯水5.4ul，模板lul。
[0015](7)PCR产物分析:将步骤(6)中的扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。
[0016]实施例1
取600ml,浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入Im3,含10条15~20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；分别取阳性标本和待测样本各5条，阳性标本和待测样本分别取80g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2~4°C下以5 OOO转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2~4°C静置2 h，以8 000转/分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬；取重悬后的溶液IOml用凯杰DNA提取试剂盒提取DNA ;上游引物AGACAACTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGAAATAG ；将 DNA 提取液在 _4°C 下以4000转/分的转速离心，取沉淀，在25°C下放置15分钟，然后进行基因扩增，扩增体系为10 X PCR缓冲液2uL，Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超纯水5.4ul，模板 lul。
[0017] 将上述扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。
[0018]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，检测步骤包括: (1)副溶血性弧菌阳性标本制备:取300~800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入lm3，含10条15~20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本； (2)副溶血性弧菌浓缩富集:分别取阳性标本和待测样本各4~5条，阳性标本和待测样本分别取20~100g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2~4°C下以5 000转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2~4°C静置2 h，以8 000转/分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬； (3)副溶血性弧菌核酸提取:将步骤(2)中5~IOml溶液用凯杰DNA提取试剂盒提取 DNA ； (4 )引物设计:上游弓丨物 AGACMCTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGMATAG ； (5)模板制备:将步骤(3)中获得的提取液在_4°C下以4000转/分的转速离心，取沉淀，一定温度下放置15~30分钟； (6)基因扩增:将步骤(5)中制备的模板放置于PCR扩增体系中进行基因扩增； (7)PCR产物分析:将步骤(6)中的扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。
2.根据权利要求1所述的水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中副溶血性弧菌原液体积为600ml。
3.根据权利要求1所述的水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中标本和待测样本的鱼鳞分别为80mg。
4.根据权利要求1所述的水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的溶液为10ml。
5.根据权利要求1所述的水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中放置温度为25°C。
6.根据权利要求1所述的水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(6)中PCR扩增体系为10 X PCR缓冲液2uL，Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超纯水5.4ul，模板lul。
【文档编号】C12Q1/04GK103740813SQ201310657472
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】杜伟林 申请人:苏州市相城区新时代特种水产养殖场