一种新型β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus?usamii?E001的β-1，4-甘露聚糖酶基因的克隆方法，其核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1，命名为Auman26A。生物信息学分析表明该甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第26家族，命名为AuMan26A，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：2。本发明还公开了AuMan26A基因在毕赤酵母中异源表达、活性测定及酶学性质的分析方法，制备的重组酶热稳定性极好，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
【专利说明】—种新型β-1,4-甘露聚糖酶(AUMan26A)的制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii EOOl的β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因的克隆、异源表达、活性测定及酶学性质的分析方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]β -甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是内切β -1,4-甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称，能够随机催化甘露聚糖分子主链中β -1, 4-D-甘露糖苷键的水解，是甘露聚糖降解酶系中最重要的组分，属于半纤维素酶类。它广泛存在于多种生物体内，在食品、医药、饲料、纺织、纸浆漂白、能源开发等众多领域具有重要的应用价值。基于一级结构的同源性和疏水簇分析，绝大多数β -甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶(GH)第5或26家族。而GH5和GH26家族的β_甘露聚糖酶的活性位点作用模式不尽相同，从而表现出各自特异的生物学性质。近年来的研究表明GH26家族β -甘露聚糖酶在催化活性和热稳定性方面具有较为优良的特性，这为GH26家族β-甘露聚糖酶的深入研究提供了参考。自然界微生物中具有丰富的酶资源，利用生物信息学和基因组学相结合的方法从微生物中挖掘具有优良性状的新型酶是一条获取优良酶的有效途径。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii EOOl的β_1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因克隆、异源表达及酶学性质的分析方法，为拓展β _甘露聚糖酶的研究领域奠定了理论基础，同时为其它新型酶的挖掘提供了新的策略。
[0004]A.usamii EOOl菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol.31，N0.4，Pg.50公 开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
[0005]本发明的技术方案:基于NCBI上AspergillusnigerCBS513.88菌株的基因组序列，参照推测出的黑曲霉GH26家族β -甘露聚糖酶序列，借助RT-PCR技术从A.usamiiEOOl中克隆出AuMan26A的编码基因，通过pPIC9KM质粒在毕赤酵母GS115中实现了天然N端异源表达并检测其酶学性质。
[0006]所述的一种源自宇佐美曲霉A.usamii EOOl菌株新型基因Auman26A对应的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0007]所述的能够实现天然N端表达的质粒pPIC9KM已申请专利(专利申请号:201110410391.0)。
[0008]所述的重组甘露聚糖酶的活性测定方法:
[0009]采用改良的DNS试剂法，取2.4mL5mg / ml角豆胶溶液(ρΗ5.5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制)于40°C预热5min后加入0.1mL适当稀释的酶液,40°C下准确反应10min,加入2.5mL DNS试剂，沸水浴中显色7min，加入5mL去离子水混匀后测定0054(|。在上述反应条件下，每分钟产生I μ rnol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量定义为I个酶活性单位(U)。[0010]所述的Auman26A基因克隆、异源表达:
[0011](l)AuMan26A成熟肽的编码基因的克隆:基于宇佐美曲霉与黑曲霉基因序列的相似性，参照NCBI上公布的A.niger CBS 513.88菌株基因组中推测的Man26A的基因序列(登录号:XM_001397260.1)，结合生物信息学分析的手段，设计出一对扩增编码AuMan26A成熟肽cDNA的特异性上下游引物。
【权利要求】
1.一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii EOOl的β-1,4-甘露聚糖酶基因Auman26A，其对应的核苷酸和蛋白质序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.Auman26A基因克隆、异源表达、活性测定及分析和酶学性质分析方法: (1)Auman26A基因的克隆:基于宇佐美曲霉与黑曲霉基因序列的相似性，参照NCBI上公布的A.nigerCBS513.88菌株基因组中推测的Man26A的基因序列(登录号:XM_001397260.1)，结合生物信息学分析的手段，设计出一对扩增编码AuMan26A成熟肽cDNA的特异性上下游引物AuMan26A-F和AuMan26A_R:
【文档编号】C12N15/56GK103642826SQ201310666414
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】李剑芳, 赵梅, 王春娟, 董运海, 邬敏辰 申请人:江南大学