一种提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法
【专利摘要】本发明提出了一种新型的利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行定向改造的方法，运用基因工程技术构建出了具有高效表达能力的突变木聚糖酶工程菌。将来源于米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC40186菌株的常温木聚糖酶进行热稳定性的定向改造，获得了一种木聚糖酶突变体，其热稳定性有了一定的提高，而其催化活性较原酶无明显改变。作为一种耐热型的酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和应用价值。
【专利说明】一种提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC40186菌株的常温木聚糖酶(AoXynllA)热稳定性的定向改造,表达热稳定性好的木聚糖酶突变体的工程菌构建及重组木聚糖酶突变体高效表达的方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链，随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。近年来，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在低聚木糖的制备中，而关于它的研究报道也日益增多。在低聚木糖的酶法制备中，适当地提高反应温度可以加快反应的速度，同时还能降低染菌的风险。因此，热稳定性好的酶在低聚木糖的制备中也更具优势。目前，开发耐热型木聚糖酶的研究主要包括从高温环境中筛选获得耐高温的能产木聚糖酶的微生物菌株和利用基因工程技术对酶分子进行定向改 造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，更受国内外学者的青睐。
[0003]基于对木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其归为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/ 11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型，可以用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究。基因工程技术、生物信息学以及计算机科学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高其热稳定性，加速木聚糖酶在各种领域中的应用进程。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种新型的利用计算机技术与生物信息学分析对常温木聚糖酶的热稳定性进行理性改造的方法，构建出能表达热稳定性好的木聚糖酶突变体工程菌并实现重组木聚糖酶突变体的高效表达。由定向改造得到的突变木聚糖酶命名为AoXynllA?，其相应的基因为AoxynllA?，其热稳定性有了一定的提高，而酶的催化活性较原酶没有明显改变，有较大的工业应用潜力以及经济价值。
[0005]本发明的技术方案:对一种来源于A.0ryzae CICC40186的木聚糖酶(AoXynllA)在计算机辅助下进行理性设计，得到一种木聚糖酶突变体:AoXynllAN9H，其完整的DNA和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0006]所述的源自A.0ryzae CICC40186的第11家族的木聚糖酶命名为AoXynllA,其相应的基因命名为AoxynlIA(GenBank accession N0.JQ326257);采用的模板为同家族的超耐热木聚糖酶，将其命名为EvXynllTS,基因序列为本实验室合成基因Syxynll (GenBankaccession N0.JX459567)。[0007]所述的重组木聚糖酶的活性测定方法:
[0008]于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH5.5、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为0.5%的榉木木聚糖(Sigma, USA)溶液2.4mL, 50°C预热IOmin,在A管中加入0.1mL适当稀释倍数的酶液，50°C准确反应15min ;立即各加入2.5mL3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义:在本测定条件下，以每分钟产生I μ mo I还原糖所需的酶量定义为I个木聚糖酶活性单位(IU)。
[0009]所述的耐热木聚糖酶突变体的设计及表达方法:
[0010](I)AoXynllA的空间结构的模拟:登录蛋白质结构数据库Protein databank (http: / / rcsb.0rg),经BLAST比对,找到与AoXynllA具有高度同源性的序列。本实验选择具有非常高的热稳定性的EvXynlIts (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，两者的同源性为66.49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为AoXynllA模拟空间结构。运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。
[0011](2)热稳定性提高的木聚糖酶突变体的理性设计:通过序列分析和预测，对AoXynIIA的N端第9位氨基酸进行定点突变，将原来的天冬酰胺替换为组氨酸，在结构上引入咪唑环。再利用分子动力学 模拟软件包对木聚糖酶原酶及突变体进行分子动力学模拟。
[0012](3)含突变基因AoxynllAN9H重组表达质粒的构建:根据上述的分析结果及GenBank 上 AoxynllA 的基因序列(GenBank accession N0.JQ326257)设计 2 条引物:
[0013]Xynl1-Fn9h:5 ' -CTCGAGAAAAGATCCACACCCAGTAGCACGGGCTATCACAATGGCTA-3 '，含有Xho I酶切位点；
[0014]Xynll-R:5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含有 Not I 酶切位点:
[0015]以含有Aoxynl IA的质粒为模板，Xynl 1-Fn9h和Xynl 1-R为引物进行PCR，反应条件为:94°C 5min ；94°C 30s,51°C 30s, 72°C 58s，30 个循环；72°C IOmin ;对该 PCR 产物进行核酸电泳及割胶回收，然后连接PUCm-T载体验证、测序，测序正确的pUCm-T-AoxynllA?与载体pPIC9KM(已申请专利，专利号201110410391.0)质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9KM-AoxynllAN9H，并对重组表达质粒进行序列测定。
[0016](4) GSl 15 / AoxynlIAn9h重组子的构建、表达及酶活性测定:用Sac I对pPIC9KM-AOXynllAN9H进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115 / AoXynllAN9H;该工程菌用1.0%甲醇诱导96h，离心上清液为重组突变木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较:在0.5%的榉木木聚糖底物、反应时间为15min的情况下,^4(^111]^?的最适温度由原酶的55°C提高为60°C;在60°C预处理下，reAoXynllA?的半衰期由原酶的Imin延长至18min。
[0017]本发明的有益效果:本发明对米曲霉常温木聚糖酶进行了定向改造，在保持原酶催化活性的基础上，提高了该酶的热稳定性，使其具有更好的工业应用前景。
【专利附图】
【附图说明】[0018]图1:重组质粒pPIC9KM_AoxynllAN9H的构建示意图【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0020]实施例1AoXynllA及其突变体空间结构的模拟
[0021]登录蛋白质结构数据库Protein data bank (http: / / rcsb.0rg),经 BLAST比对，找到与AoXynllA具有高度同源性的序列。本实验选择具有非常高的热稳定性的EvXynl ITS (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，两者的同源性为66.49 %，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为AoXynllA及其突变体模拟出空间结构。运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。
[0022]实施例2AoXynlIA及其突变体的分子动力学模拟
[0023]分别对模拟出的AoXynllA和AoXynllAN9H的空间结构进行分子动力学模拟。主要包括以下几步:
[0024]首先我们对空间结构进行预处理，使用GR0MACS中的pdb2gmx命令添加所有缺失的氢原子，并输出一个包含所有原子信息的.gro文件。该命令的格式为:
[0025]pdb2gmx-flibs, pdb-ollbs.gro-pllbs.top-1gnh-ter
[0026]第二步利用GR0MACS 中的 editconf 和 genbox 命令为 AoXynllA 和 AoXynl IAn9h 的空间结构添加适当的水溶液来模拟它们在水溶液中的运动。其中溶剂采用TIP3P水模型，对于模拟的体系，在溶质外围加上1.5am的水分子层。其具体过程是首先使用editconf命令定义盒子的大小，然后用genbox命令读入GR0MACS的结构文件,并读入水盒子的大小,输出文件包含分子文件和水盒子。同时genbox更改原来的top文件,使其含有水分子。该命令的格式为:
[0027]Editconf-flibs.gro_ollbs_box.gro-bt cubic-dl.5
[0028]Genbox_cpllbs_box.gro-cs-pllbs.top-ollbs_water.gro
[0029]第三步用金属离子平衡体系的电荷,命令格式为:
[0030]grompp-f em.mdp-cllbs_water_ion.gro-pllbs.top-o minimize_water.tpr
[0031]genion-s minimize_water.tpr~oIlbs_water_ion.gro-pllbs.top-pnameNa+-nplO-random-g trp_ion.log
[0032]genion-s minimize_water.tpr~oIlbs_water_ion.gro-pllbs.top-nnameCL—nnl-random-g trp_ion.log
[0033]并且需要手动对得到的llbs_water_ion.gro与libs, top文件中的原子数目进行修改，与添加的金属离子相匹配。
[0034]第四步分别利用grompp和mdmn两个命令进行能量最小化处理。首先约束溶质，用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步。然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化。命令格式为:
[0035]grompp-f emstl.mdp-cllbs_water_ion.gro-pllbs.top-o minimize_water.tpr
[0036]mdrun-s minimize_water.tpr_o minimize_water.trr-c minimize_water.gro-eminimize_water.edr-g minimize_water.log[0037]grompp-f emst.mdp-c minimize—water, gro-pllbs.top-o minimize—water, tpr
[0038]mdrun-s minimize—water, tpr-o minimize—water, trr-c minimize—water2.gro-e minimize—water, edr-g minimize—water, log
[0039]第五步分子动力学模拟分为两步，首先进行20ps的约束溶质的MD模拟，此时模拟温度从OK逐步升高到300K ;然后进行500ps的无约束恒温MD模拟。命令格式为:
[0040]grompp-f pr.mdp-c minimize—water2.gro-pllbs.top-o minimize—waterL tpr
[0041]mdrun-s minimize—waterL tpr-o minimize—waterL trr-c minimize—waterLgro-e minimize—waterL edr-g minimize—waterL log
[0042]grompp-f full, mdp-c minimize—waterl.gro-pllbs.top-o minimize—water2.tpr
[0043]mdrun-s minimize—water2.tpr-o minimize—water2.trr-c minimize—water3.gro-e minimize—water2.edr-g minimize—water2.log
[0044]最后得到其总体能量，RMSD值及各个氨基酸的B-factOT值。命令格式为:
[0045]g_rms-s minimize—waterL tpr-f minimize—waterL trr-o rms.xvg
[0046]xmgrace-nxy rms.xvg
[0047]g—rmsf-s minimize—water2.tpr-f minimize—water2.trr-b400-e600-o rmsf.xvg-oql.pdb
[0048]xmgrace-nxy rmsf.xvg
[0049]g—energy-f minimize—water2-o energy, xvg`[0050]xmgrace-nxy energy, xvg
[0051]实施例3GS115 / AoxynlIAn9h重组子的构建、表达及酶活性测定
[0052]用Sac I对pPIC9KM-AoXynllAN9H进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115 / AoXynllAN9H;该工程菌用1.0%甲醇诱导96h，离心上清液为重组突变木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较:在0.5 %的榉木木聚糖底物、反应时间为15min的情况下，AoXynlIA?的最适温度由原酶的55°C提高为60°C,其在60°C下的半衰期由原酶的Imin延长至18min。
【权利要求】
1.一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体AoXynl 1AN9H，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2。
2.耐热木聚糖酶突变体的设计及表达方法: (1)AoXynllA的空间结构的模拟:登录蛋白质结构数据库，经BLAST比对，找到与AoXynl IA具有闻度同源性的序列；本实验选择具有非常闻的热稳定性的EvXynlIts (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，两者的同源性为66.49 %，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为AoXynllA模拟空间结构；运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型； (2)热稳定性提高的木聚糖酶突变体的理性设计:通过序列分析和预测，对AoXynllA的N端第9位氨基酸进行定点突变，将原来的天冬酰胺替换为组氨酸，在结构上引入咪唑环；再利用分子动力学模拟软件包对木聚糖酶原酶及突变体进行分子动力学模拟； (3)含突变基因AoxynlIAn9h重组表达质粒的构建:根据上述的分析结果及GenBank上AoxynllA 的基因序列(GenBank accession N0.JQ326257)设计 2 条引物:
Xyn 11-Fn9h:5/ -CTCGAGAAAAGATCCACACCCAGTAGCACGGGCTATCACAATGGCTA-3'，含有 XhoI酶切位点； Xynll-R:5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含有 Not I 酶切位点； 以含有AoxynllA的质粒为模板，Xyn11-Fn9h和Xynll-R为引物进行PCR，反应条件为:940C 5min ；94°C 30s, 51 °C 30s, 72°C 58s，30 个循环；72°C IOmin ;对该 PCR 产物进行核酸电泳及割胶回收，然后连接PUCm-T载体验证、测序，测序正确的pUCm-T-AoxynllA?与载体pPIC9KM(已申请专利，专利号201110410391.0)质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9KM-AoxynllAN9H，并对重组表达质粒进行序列测定； (4)GSl 15 / Aoxynl 1A?重组子的构建、表达及酶活性测定:用Sac I对pPIC9KM-AOXynllAN9H进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115 / AoXynllAN9H;该工程菌用1.0%甲醇诱导96h，离心上清液为重组突变木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较:在0.5%的榉木木聚糖底物、反应时间为15min的情况下,^4(^111]^?的最适温度由原酶的55°C提高为60°C;在60°C热处理下，reAoXynllA?的半衰期由原酶的Imin延长至18min。
【文档编号】C12R1/84GK103642777SQ201310666413
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】庞庆丰, 朱天地, 殷欣, 陈忠法, 邬敏辰, 李剑芳 申请人:江南大学