具有耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用甘薯淀粉废水和菌糠废渣生产具有耐受重金属特性的高效解磷日本霉菌剂的方法，属于环境生物【技术领域】。高效解磷日本曲霉菌（Aspergillusjaponicus）是由我们实验室从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的，具有耐受多种重金属的特性。该方法主要是以甘薯淀粉废水和菌糠废渣为主要培养基原料，采用液态-固态联合发酵的方法生产耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂。该菌剂的生产方法包括：培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、固态发酵、后处理6个步骤。本发明技术方案不仅为高浓度甘薯淀粉废水和菌糠废渣的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的日本曲霉菌剂具有对环境友好，生产成本低的特点，产品还具有明显改善土壤环境质量、促进植株生长的功能。
【专利说明】具有耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境生物【技术领域】，具体涉及一种利用甘薯淀粉废水和菌糠废渣为主要培养基原料，通过液态-固态联合发酵生产耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂的方法。
【背景技术】
[0002]磷元素是植物生长所必须的元素，其重要性仅次于氮。但是，植物需要的氮元素可以通过土壤中以及根部的固氮菌和硝化细菌将空气中的氮气转化为硝态氮来实现，但是所需磷元素只能通过吸收土壤中的可溶性磷来满足。土壤中，尤其是矿区土壤中，由于存在大量的重金属，而重金属又极其容易和可溶性磷元素形成难溶性的磷酸化合物，如AlPO4,Ca3(PO4)2和FePO4等，因而造成土壤中磷元素的缺乏。目前国内外常用的改善土壤磷元素的方法是施加磷肥，然而过量地向土壤中施磷肥，不仅造成了大量的经济损失，同时带来各种环境污染的问题。
[0003]解磷微生物是大量存在于土壤中的一个类群，具有将难溶性的磷酸化合物降解为可溶性的磷化合物以及释放质子的作用，因此解磷微生物可以起到提高土壤中植物可吸收的磷元素的含量以及促进植物的生长起到的作用。此外，一些解磷微生物还可以促进植物根瘤的形成。目前，对解磷微生物的研究主要集中在解磷细菌方面，解磷真菌方面的研究相对较少。例如:中国发明专利(申请号:201110121381.5)公开了一株南方红豆杉根际高效解磷嗜松青霉及其应用；中国发明专利(申请号:201210235182.1)公开了一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉及其应用。
[0004]矿山开采造成矿区大片植被和耕地被破坏，同时还产生大量矿业废物，严重影响土壤质地和结构。矿山开采所产生的大量酸性矿井水和尾砂矿是造成矿区及其周围地区生态系统重金属污染的主要原因之一，成为环境中重金属污染的主要污染源。近年来，国内外关于矿区土地复垦和生态重建的研究十分活跃，其中适生优良先锋植物种类的筛选和培育是一种行之有效的方法。然而矿区复垦地土壤重金属污染严重，而且土壤的肥力低，尤其是有效磷含量低的问题，是限制矿区复垦地植被重建的重要因素。
[0005]本专利涉及的菌种是从湖南省湘西州花垣县的铅锌尾矿区分离筛选出的一株高效解磷日本曲霉，而且该菌株对Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+等重金属具有很强的抗性。目前关于解磷日本曲霉促进植物在矿区土壤生长方面的研究在国内外还未见相关报道。因此，通过对这株从矿区污染地筛选到的耐受重金属的高效解磷真菌的利用，对调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤肥力，促进当地植被生长具有重要意义。
[0006]甘薯易腐烂，不宜长期存放。甘薯的深加工，可以解决因贮存鲜薯不当而导致大量烂薯的现象，甘薯精制淀粉经过不同深度的加工，可生产出数百种有价值的产品，增值10-30倍左右。但是，目前的加工工艺，每生产I吨甘薯淀粉大约产出6吨高浓度有机废水，这些废水的COD值高达10000 mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白质、果胶、有机酸及少量的油脂，易腐败发酵，使水质发黑发臭，排入河流会消耗水中的溶解氧，促进藻类及水生植物繁殖，量大时河流严重缺氧，发生厌氧腐败，散发恶臭，鱼、虾、贝类等水生动物可能会因此而窒息死亡。而采用一般污水处理工艺将如此高浓度的废水处理达标，消耗惊人。从另一个角度考虑，甘薯淀粉废水中的有机质(包括:蛋白质、果胶、糖类等)是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基，发酵生产微生物产品。菌糠废料是蘑菇生产后的剩余固体废物，富含纤维素、木质素及菌体蛋白等营养成份，可以用做固态发酵的培养基质，并为微生物提供一定的营养物质。
[0007]本专利发明了一种利用甘薯淀粉废水和菌糠废渣为主要培养基原料，通过液态-固态联合发酵生产耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂的方法。目前尚未发现文献报道用甘薯淀粉废水和菌糠废料生产高效解磷日本曲霉菌剂的生产方法。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种利用甘薯淀粉废水和菌糠废渣为主要培养基原料，通过液态-固态联合发酵生产耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂的方法。
[0009]为了实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案如下:
本发明采用的高效解磷、耐受重金属的菌株是由我们实验室从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的，将其编号为TJ1。经形态学、培养特征以及18SrDNA的ITS序列测序分析，鉴定该菌株为草酸青霉菌，分类命名为日本曲霉japonicus),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCN0.7700，保藏日期为2013年6月14日。
[0010]本发明所述的菌剂的生产方法如下:
1、培养基配制:
1)菌种保藏培养基(固体，1L):葡萄糖5 g，琼脂18-20 g，40 g马铃薯煮沸过滤成的浸出液，加甘薯淀粉废水定容至1L，自然pH ;
2)菌种活化培养基(液体,IL):葡萄糖5 g，40 g马铃薯煮沸过滤成的浸出液，加甘薯淀粉废水定容至1L，自然pH;
3)种子培养基(液体，10L):蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 10 g，MgSO4 ? 7H20 5g，加甘薯淀粉废水定容至10 L，自然pH ;
4)发酵培养基(液体，200L) =KH2PO4 200 g, KH2PO4 100 g, MgSO4 ? 7H20 20 g，加甘薯淀粉废水至200 L，自然pH ;
以上培养基均在121°C灭菌15-30 min。
[0011]2、菌种活化:挑取日本曲霉菌至菌种保藏培养基，28°C连续划线、挑单菌落培养两次后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为1.0X IO8个孢子/mL，按5% (V/V)接种量挑取单菌落在菌种活化培养基中，于28°C，150 r/min摇床振荡培养4d。
[0012]3、液体种子制备:向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5% -10%的接种量接种日本曲霉菌，于25-30°C，通空气好氧培养48-72 h，得到液体种子。
[0013]4、液态发酵:向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5% -10%的接种量接种日本曲霉菌液体种子，于25-30°C，通空气好氧培养48 - 72 h，得到活菌体培养物。
[0014]5、固态发酵:以蘑燕洛为支持物,将培养好的液态种子或液态日本曲霉菌产物按照2.5-4倍重量添加到蘑菇渣物料中，搅拌均匀，于25-30°C，静态培养5_15天，得到固态日本曲霉菌产物。
[0015]6、后处理:固态日本曲霉菌产物以分子孢子为主，将固态日本曲霉菌发酵产物经通风干燥处理，使其含水量小于30%，粉碎，包装，保存于干燥阴凉处。
[0016]【具体实施方式】:
由本发明技术方案生产的耐受重金属的高效解磷日本曲霉菌剂，具有对环境友好，生产成本低的特点，产品能明显改善土壤环境质量、促进植株生长。同时为高效处理甘薯淀粉生产过程中产生的大量高浓度有机废水和食用菌菌糠废料找到有效的处理方法。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。 [0017]实施例1:耐受重金属的闻效解憐日本曲霉霉囷囷剂生广
1、培养基配制:
1)菌种保藏培养基(固体，IL):葡萄糖5 g，琼脂18-20 g，40 g马铃薯煮沸过滤成的浸出液，加甘薯淀粉废水定容至1L，自然pH ;
2)菌种活化培养基(液体,IL):葡萄糖5 g，40 g马铃薯煮沸过滤成的浸出液，加甘薯淀粉废水定容至1L，自然pH;
3)种子培养基(液体，10L):蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 10 g，MgSO4 ? 7H20 5g，加甘薯淀粉废水定容至10 L，自然pH ;
4)发酵培养基(液体，200L) =KH2PO4 200 g, KH2PO4 100 g, MgSO4 ? 7H20 20 g，加甘薯淀粉废水至200 L，自然pH ;
以上培养基均在121°C灭菌15-30 min。
[0018]2、菌种活化:挑取日本曲霉菌至菌种保藏培养基，28°C连续划线、挑单菌落培养两次后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为5.0X IO8个孢子/mL，按5% (V/V)接种量挑取单菌落在菌种活化培养基中，于28°C，150 r/min摇床振荡培养4d。
[0019]3、液体种子制备:向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5% -10%的接种量接种日本曲霉菌，于25-30°C，通空气好氧培养48-72 h，得到液体种子。
[0020]4、液态发酵:向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5% -10%的接种量接种日本曲霉菌液体种子，于25-30°C，通空气好氧培养48 - 72 h，得到活菌体培养物。
[0021]5、固态发酵:以蘑菇渣为支持物，将培养好的液态种子或液态日本曲霉菌产物按照2.5-4倍重量添加到蘑菇渣物料中，搅拌均匀，于25-30°C，静态培养5_15天，得到固态日本曲霉菌产物。
[0022]6、后处理:固态日本曲霉菌发酵产物以分子孢子为主，将固态日本曲霉菌发酵产物经通风干燥处理，使其含水量小于30%，粉碎，包装，保存于干燥阴凉处。
[0023]实施例2:高效解磷日本曲霉菌菌剂对翅荚木生长促进效果
将上述制备好的日本曲霉菌剂按照与土壤1:20、1:15,1:10,1:5的比例混合均匀后，种植已经萌芽的翅荚木种子，以添加1:10比例未经日本曲霉发酵的菌糠废渣为对照。每个处理5盆，每一盆种3棵苗，置于温室统一管理，定期浇水。翅荚木种植出苗60天后，生长情况见表1。可以看出，接种日本曲霉菌菌剂的植物，各个添加比例的根、苗的干重及苗高和根长较对照组均所有增加，随着添加比较的增大，根、苗的干重及根长、苗高呈递增的趋势，但添加比例超过1:10以上时，根、苗干重及苗高、根长基本不再增加。
[0024]表1日本曲霉菌菌剂对翅荚木植株生长的作用
【权利要求】
1.一种利用甘薯淀粉废水和菌糠废渣生产耐受重金属特性的高效解磷日本曲霉菌剂的方法，其特征在于，该方法以甘薯淀粉废水和菌糠废渣为主要培养基原料，进行液态-固态联合发酵生产日本曲霉菌剂，，生产方法包括如下步骤。
2.根据权利要求1的日本曲霉菌剂的生产方法，所述的培养基配制如下:菌种保藏固体培养基:蔗糖5 g，琼脂18-20 g，40 g马铃薯煮沸过滤成的浸出液，加甘薯淀粉废水定容至1L，自然pH ;菌种活化液体培养基:蔗糖5 g，40 g马铃薯煮沸过滤成的浸出液，加甘薯淀粉废水定容至1L，自然pH;液体种子培养基:蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，KH2P04 10 g，MgS04.7H20 5 g，加甘薯淀粉废水定容至10 L，自然pH;液体发酵培养基:ΚΗ2Ρ04 2 00 g，ΚΗ2Ρ04 1 00 g，MgS04.7H20 20 g，加甘薯淀粉废水至200 L，自然 pH;以上培养基均在121°C灭菌15-30 min。
3.根据权利要求1的日本曲霉菌剂的生产方法，所述的菌种活化为:挑取日本曲霉菌至菌种保藏培养基，28°C连续划线、挑单菌落培养两次后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为1.0X 108个孢子/mL，按5% (V/V)接种量挑取单菌落在菌种活化培养基中，于28°C，150 r/min摇床振荡培养4d。
4.根据权利要求1的日本曲霉菌剂的生产方法，所述的液体种子制备:向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5% -10%的接种量接种日本曲霉菌，于25-30°C，通空气好氧培养48-72 h，得到液体种子。
5.根据权利要求1的日本曲霉菌剂的生产方法，所述的液态发酵:向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5% -10%的接种量接种日本曲霉菌液体种子，于25-30°C，通空气好氧培养48 - 72 h，得到活菌体培养物。
6.根据权利要求1的日本曲霉菌剂的生产方法，所述的固态发酵:以蘑菇渣为支持物，将培养好的液态种子或液态日本曲霉菌产物按照2.5-4倍重量添加到蘑菇渣物料中，搅拌均匀，于25-30°C，静态培养5-15天，得到固态日本曲霉菌产物。
7.根据权利要求1的日本曲霉菌剂的生产方法，所述的后处理:固态日本曲霉菌产物以分子孢子为主，将固态日本曲霉菌发酵产物经通风干燥处理，使其含水量小于30%，粉碎，包装，保存于干燥阴凉处。
【文档编号】C12N1/14GK103642703SQ201310671355
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】不公告发明人 申请人:北京林业大学