具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂及其制备方法，包括将枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、硝化刺菌、反硝化短枝单胞菌分别与培养基混合后进行好氧或发酵得到菌剂，将上述的菌剂按比例混合得到所需的生物制剂；所述的微生物制剂中包括枯草芽孢杆菌菌剂5-30%、沼泽红假单胞菌菌剂10-40%、硝化刺菌菌剂10-60%、反硝化短枝单胞菌菌剂10-40%。本发明所述的制备方法可规模化生产，效率高且成本低，多种菌剂可同时发酵制备，缩短时间。采用所述的制剂制得的膜细胞密度高、传质性好、稳定、有效期长、可重复使用，所述的制剂还可提高生物膜生长速度，缩短生物膜的挂膜时间，提高生物膜中优势微生物的数量。
【专利说明】具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物制剂，尤其涉及一种具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]生物膜的使用方法是使废水流过生长在固定支承物表面上的生物膜，利用生物氧化作用和各相间的物质交换，降解废水中有机污染物的方法，是废水需氧生物处理法的一种。用生物膜法处理废水的构筑物有生物滤池、生物转盘和生物接触氧化池等。生物膜是由高度密集的好氧菌、厌氧菌、兼性菌、真菌、原生动物以及藻类等组成的生态系统，其附着的固体介质称为滤料或载体。
[0003]生物膜自滤料向外可分为厌气层、好气层、附着水层、运动水层。生物膜法的作用原理是，生物膜首先吸附附着水层有机物，由好气层的好气菌将其分解，再进入厌气层进行厌气分解，流动水层则将老化的生物膜冲掉以生长新的生物膜，如此往复以达到净化污水的目的。
[0004]专利CN1928081B公开了一种人造生物膜及制备方法。采用有益微生物菌株发酵后浓缩。以聚乙烯醇、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠等成膜原材料溶于水中制成胶液后，再将煤基活性炭粉末、硅藻土粉末、醋酸钠与单株或多株微生物细胞混合后加入胶液中，然后放在喷雾装置中加压喷雾滴入粉末床上固定，形成人造生物膜。
[0005]生物膜的制备 生长还可以为挂膜，挂膜是指在污水中的微生物附着后，慢慢生长的过程。生长的时间一般需要15天-20天才能挂膜完成。生物膜上的微生物种类很多，有细菌、真菌、藻类、原生动物和后生动物，以及肉眼可见的微型动物。生物滤池中上层、中层、下层构成生物膜的微生物，种类也有区别，因此其挂膜的时间也不尽相同。挂膜的时间过长，不利于生物膜的广泛应用和长期循环使用。
[0006]为了解决挂膜时间长、工序较多的问题，专利CN202829708U公开了一种悬浮填料微生物快速挂膜的方法。其特征是首先将污泥取回后曝气48h，用曝气后的污泥做接种菌，接种于装有悬浮填料的序批式SBR反应器中，曝气6h，静置沉淀6h ;然后投加营养基质，曝气10h，静置沉淀2h作为一个运行周期，每天运行2个周期，期间进行排泥保持污泥悬浮固体浓度保持在2-20g/L范围内的某一浓度值不变；运行7-10d挂膜完成。
[0007]上述的专利主要是在操作方法、流程上进行改进，虽然提高了挂膜的速度，但是却使原有的挂膜的工序更为复杂，不利于推广使用。
【发明内容】
[0008]本发明目的是一种有效提高生物膜挂膜效率的生物制剂及其制作方法。
[0009]为实现上述目的，本发明的第一个方面提供了一种具有高生物膜挂膜效率的生物制剂的制备方法，具体步骤包括:
[0010]步骤1，枯草芽孢杆菌、硝化刺菌、反硝化短枝单胞菌分别单独进行好氧通气发酵培养得菌剂，沼泽红假单胞菌进行厌氧光照发酵培养得菌剂；
[0011]步骤2，将步骤1得到的各菌剂混合，得所需的生物制剂，其中，各菌剂混合的重量比例为枯草芽孢杆菌菌剂5-30%、沼泽红假单胞菌菌剂10-40%、硝化刺菌菌剂10-60%、反硝化短枝单胞菌菌剂10-40%。
[0012]上述的步骤1中好氧发酵前枯草芽孢杆菌与培养基的混合重量比例优选为1-10:90-99，更优选为 1-3:97-99。
[0013]上述的步骤1中好氧通气发酵的温度优选为30_39°C，更优选为35_38°C，最优选为37°C，发酵时间优选为1-5天，更优选为1-3天，最优选为2天。
[0014]上述的步骤1中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)优选为保藏编号为N0.ACCC10619 的菌种。
[0015]上述的步骤1中所述的培养基为豆柏粉、蛋白胨、玉米粉、蔗糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸铵、尿素或无菌水中的至少两种混合物。
[0016]上述的步骤1中所述枯草芽孢杆菌好氧通气发酵培养过程中的培养基，按照重量百分配比，包括:豆柏粉2.0-3.5%、蛋白胨0-1.0%、玉米粉3-4%、葡萄糖0_4%、磷酸氢二钠0-1%、磷酸二氢钾0-1%、硫酸铵0-2%、尿素0-1%、水82.5-95%。
[0017]上述的步骤1中所述的厌氧光照发酵前沼泽红假单胞菌与培养基混合重量比例优选为1-15:85-99，更优选为2-13:90_99，更优选为5-10:90_95。
[0018]上述的步骤1中厌氧光照发酵的温度优选为30_38°C，更优选为30_35°C，更优选为32°C，厌氧光照发酵的时间优选为2-10天，更优选为3-8天，最优选为5天。
[0019]上述的步骤1中所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)优选为保藏编号为N0.ACCC10649的菌种。
[0020]上述的步骤1中所述的培养基为酵母粉、乙酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠或无菌水中的至少两种混合物。
[0021]上述的步骤1中所述的沼泽红假单胞菌厌氧光照发酵培养过程中的培养基，按照重量百分配比，包括:酵母粉1-2%、乙酸钠1-5%、硫酸铵1-3%、磷酸二氢钾0-1%、硫酸镁0-1%、氯化钠 0.5-1%、水 87-99.2%。
[0022]上述的步骤1中硝化刺菌和培养基的混合重量比例优选为1-15:85-99,更优选为3-12:90-99，更优选为 5-10:90_95。
[0023]上述的步骤1中所述的硝化刺菌进行发酵的温度优选为25_35°C，更优选为25-300C，最优选为28°C，发酵的时间优选为2-7天，更优选为2_5天，最优选为3天。
[0024]上述的步骤1中所述的硝化刺菌(Nitrospina sp)优选为保藏编号为N0.MCCC1A00556 的菌种。
[0025]上述的步骤1中所述的培养基为碳酸氢钠、亚硝酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、无菌水的至少两种混合物。
[0026]上述的步骤1中所述的硝化刺菌厌氧光照发酵培养过程中的培养基，按照重量百分配比，包括:碳酸氢钠0.1-0.5%、亚硝酸钠0.1-0.5%、碳酸钠0.1-0.5%、磷酸二氢钾0-1%、硫酸镁 0-1%、氯化钠 0.5-1%、水 95.5-96.5%。
[0027]上述的步骤1中反硝化短枝单胞菌与培养基的混合重量比例优选为1-8:92-99,更优选为1-5:95-99，更优选为1-2:98_99。[0028]上述的步骤I中所述的发酵的温度优选为25_35°C，更优选为25_30°C，最优选为28°C，所述的发酵的时间优选为1-8天，更优选为1-5天，更优选为2-4天，最优选为3天。
[0029]上述的步骤I中所述的反硝化短枝单胞菌(Brachymonas denitrificans)优选为保藏编号为N0.CGMCC1.7100的菌种。
[0030]上述的步骤I中所述的培养基为醋酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙或无菌水中的至少两种混合物。
[0031]上述的步骤I中所述的反硝化短枝单胞菌好氧通气发酵培养过程中的培养基按照重量百分配比，包括:醋酸钠0.01-0.05%、硝酸钾0.01-0.05%、磷酸二氢钾
0.001-0.002%、氯化镁 0.001-0.002%、氯化钙 0.001-0.002%、水 99.894-99.97%。
[0032]本发明的第二方面是提供一种采用上述的方法制备得到的微生物制剂，包括微生物组分，以微生物组分总量为基准，包括以下重量百分比的菌种:
[0033]枯草芽孢杆菌菌剂优选为5-30%，更优选为10-25%，更优选为10_20% ；
[0034]沼泽红假单胞菌菌剂优选为10-40%，更优选为10-30%，更优选为20_30% ；
[0035]硝化刺菌菌剂优选为10-60%，更优选为20-50%，更优选为30-40% ；
[0036]反硝化短枝单胞菌菌剂10-40%，更优选为20-40%，更优选为20_30%。
[0037]本发明所述的具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂的制备方法可以实现规模化生产，过程简单、效率高且成本低，多种菌剂的发酵制备可同时进行，从而大大缩短微生物制剂的制备时间，提闻生广的效率。
`[0038]采用本发明所述的微生物制剂得到的膜中细胞密度高、传质性好、稳定、有效期长、可重复使用，还具有可提高生物膜的生长速度，缩短生物膜的挂膜时间，提高生物膜中的必要的好氧无氧的优势微生物的数量的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为本发明实施例3中对照0%接种量好氧培养期间COD去除情况随时间变化图；
[0040]图2为本发明实施例3中对照0.05%接种量好氧培养期间COD去除情况随时间变化图；
[0041]图3为本发明实施例3中对照0.075%接种量好氧培养期间COD去除情况随时间变化图；
[0042]图4为本发明实施例3中对照0.1%接种量好氧培养期间COD去除情况随时间变化图；
[0043]图5为本发明实施例3中对照0%接种量厌氧培养期间COD去除情况随时间变化图；
[0044]图6为本发明实施例3中对照0.05%接种量厌氧培养期间COD去除情况随时间变化图；
[0045]图7为本发明实施例3中对照0.075%接种量厌氧培养期间COD去除情况随时间变化图。
具体实施例[0046]生物膜法因其具有产生污泥少，运行管理方便，处理费用低等优点，在污水处理，尤其是养殖废水处理方面具有独特的优势。通过添加同属或类似的微生物，对生物膜的生长效率会有一定的提高促进作用，同时也可以缩短其挂膜的时间。因此，利用合适的微生物菌剂可以有效的提高生物膜的生长速度，提高生物膜中的必要的好氧无氧的优势微生物的数量，从而提高生物膜的质量和较少挂膜的时间。
[0047]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为本发明的限定。
[0048]实施例1
[0049]本实施例中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号为N0.ACCC10619 的菌种。
[0050]所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)为保藏编号为N0.ACCC10649 的菌种。
[0051]所述的硝化刺菌(Nitrospina sp)为保藏编号为N0.MCCC1A00556的菌种。
[0052]所述的反硝化短枝单胞菌(Brachymonas denitrificans)为保藏编号为N0.CGMCC1.7100 的菌种。
[0053]制备可具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂的方法，其具体步骤如下:
[0054]步骤1，枯草芽孢杆菌菌剂的制备。
[0055]在好氧发酵前由下述重量百分比的原料配制:枯草芽孢杆菌1，％、培养基99%，进行37°C好氧通气发酵2天。发酵后发酵液备用。
`[0056]所述的步骤I中培养基的重量百分配比为:豆柏粉2.0%、蛋白胨1.0%、玉米粉
3.0%、磷酸氢二钠0.75%、磷酸二氢钾0.2%、水93.05%。
[0057]步骤2，沼泽红假单胞菌菌剂的制备。
[0058]在厌氧光照发酵前由下述重量百分比的原料配制:沼泽红假单胞菌5%、培养基95%，进行32°C厌氧光照发酵5天。发酵后发酵液备用。
[0059]所述的步骤2中培养基的重量百分配比为:酵母粉1.0%、乙酸钠5.0%、硫酸铵
3.0%、氯化钠 0.5%、水 90.5%ο
[0060]步骤3，硝化刺菌菌剂的制备。
[0061]在好氧发酵前由下述重量百分比的原料配制:硝化刺菌10%、培养基90%，进行28°C好氧通气发酵3天。发酵后发酵液备用。
[0062]所述的步骤3中培养基的重量百分配比为:碳酸氢钠0.5%、亚硝酸钠0.1%、碳酸钠
0.5%、硫酸镁0.5%、氯化钠0.5%、水97.9%ο
[0063]步骤4，反硝化短枝单胞菌菌剂的制备。
[0064]在好氧发酵前由下述重量百分比的原料配制:反硝化短枝单胞菌1%、培养基99%，进行28°C好氧通气发酵3天。发酵后发酵液备用。
[0065]所述的步骤4中培养基的重量百分配比为:醋酸钠0.05%、硝酸钾0.05%、磷酸二氢钾 0.002%、氯化镁 0.001%、氯化钙 0.001%、水 99.896%。
[0066]步骤5，生物制剂的制备。将枯草芽孢杆菌菌剂、沼泽红假单胞菌菌剂、硝化刺菌菌剂和反硝化短枝单胞菌菌剂进行混合，其重量百分比为:枯草芽孢杆菌菌剂20%、沼泽红假单胞菌菌剂30%、硝化刺菌菌剂30%、反硝化短枝单胞菌菌剂20%。
[0067]混合后得到所需的微生物制剂。[0068]实施例2
[0069]本实施例中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号为N0.ACCC10619 的菌种。
[0070]所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)为保藏编号为N0.ACCC10649 的菌种。
[0071]所述的硝化刺菌(Nitrospina sp)为保藏编号为N0.MCCC1A00556的菌种。
[0072]所述的反硝化短枝单胞菌(Brachymonas denitrificans)为保藏编号为N0.CGMCC1.7100 的菌种。
[0073]制备具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂的方法，其具体步骤如下:
[0074]步骤1，枯草芽孢杆菌菌剂的制备。
[0075]在好氧发酵前由下述重量百分比的原料配制:枯草芽孢杆菌3%、培养基97%，进行37°C好氧通气发酵2天。发酵后发酵液备用。
[0076]所述的步骤I中培养基的重量百分配比为:豆柏粉3.0%、玉米粉4.0%、磷酸氢二钠
0.75%、磷酸二氢钾0.2% 、硫酸铵0.5%、水91.55%。
[0077]步骤2，沼泽红假单胞菌菌剂的制备。
[0078]在厌氧光照发酵前由下述重量百分比的原料配制:沼泽红假单胞菌10%、培养基90%，进行32°C厌氧光照发酵5天。发酵后发酵液备用。
[0079]所述的步骤2中培养基的重量百分配比为:酵母粉2.0%、乙酸钠5.0%、磷酸二氢钾
0.05%、硫酸镁 0.05%、氯化钠 0.5%、水 92.4%。
[0080]步骤3，硝化刺菌菌剂的制备。
[0081]在好氧发酵前由下述重量百分比的原料配制:硝化刺菌10%、培养基90%，进行28°C好氧通气发酵3天。发酵后发酵液备用。
[0082]所述的步骤3中培养基的重量百分配比为:碳酸氢钠0.5%、亚硝酸钠0.5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.5%、氯化钠0.5%、水97.5%。
[0083]步骤4，反硝化短枝单胞菌菌剂的制备。
[0084]在好氧发酵前由下述重量百分比的原料配制:反硝化短枝单胞菌2%、培养基98%，进行28°C好氧通气发酵3天。发酵后发酵液备用。
[0085]所述的步骤4中培养基的重量百分配比为:醋酸钠0.05%、硝酸钾0.03%、磷酸二氢钾 0.002%、氯化钙 0.002%、水 99.916%。
[0086]步骤5，生物制剂的制备。
[0087]将枯草芽孢杆菌菌剂、沼泽红假单胞菌菌剂、硝化刺菌菌剂和反硝化短枝单胞菌菌剂进行混合，其重量百分比为:枯草芽孢杆菌菌剂10%、沼泽红假单胞菌菌剂30%、硝化刺菌菌剂30%、反硝化短枝单胞菌菌剂30%。
[0088]实施例3
[0089]本发明所述的微生物制剂影响厌氧、好氧环境下的生物膜挂膜效率的实验。
[0090]实验目的:将复合菌接种到厌氧好氧组合的反应器中，并加入经过沉降或混凝预处理养猪场养殖废水，通过接种复合菌种，进行挂膜试验。根据添加前后的不同进行试验，考察其对于缩短挂膜时间作用及提高去除污染物的效果。
[0091]实验污水:本实验所用的畜禽养殖废水，其主要性状为水质浑浊并含有一定的杂质，颜色呈黑棕色并带有一定的臭味。本实验测试污水主要水质指标COD，其范围在3000mg/L 左右。
[0092]实验装置:本实验所用的实验装置是用有机玻璃制成的长方体，其规格为255mmX 65mmX 225mm,反应器内包括三个独立的格室，每个格室都是一个小的反应器，在每个格室中装有填料，用于培养微生物。在反应器内装有废水，对微生物进行培养驯化，注入模拟养猪场废水，利用微生物对废水中的COD进行去除。各个格室根据试验要求(好氧或厌氧)进行曝气或密封。
[0093]实验方法:本实验中对生物膜的培养和驯化是在填料上进行的，所以首先将填料固定在反应器的每个小单元内，通过拴绑使其均匀的垂直悬挂在每个小格内。然后在每个小格内加入曝气装置，以供微生物生长所需的氧气。本实验对微生物的培养分别进行厌氧和好氧条件两个组别的测试。
[0094]第一阶段是在好氧条件下培养微生物，分别向两个小格内加入人工模拟养殖废水(人工养殖废水由蔗糖、氯化铵和磷酸二氢钾加自来水配制，使其C:N:P为100:5:1，再向其中加入IOOmL的养殖废水，使其COD保持在1000mg/L左右)采用间歇法培养微生物(计量泵不进水，但连续曝气)，按照0.05%,0.075%和0.1%三个接种比例接入菌种，大约培养好氧挂膜一周结束。具体为加入模拟养殖废水，连续曝气接种到填料上，进水COD保持在1000mg/L左右，进行间歇法培养微生物，隔天测试进出水COD数值，一周以后以COD去除率为判断依据来确定好氧挂膜阶段结束及时间点。
[0095]第二阶段是在厌氧条件下培养生物膜。反应器第一格停止曝气，满足厌氧条件，第二格曝气。采用间歇法培养厌氧微生物(计量泵不进水)，加入人工养殖废水(浓度同上不变1000mg/L左右)，按照0.05%、0.075%和0.1%三个接种比例接入菌种，大约培养厌氧挂膜IOd结束。具体为当好氧微生物培养成熟，在好氧微生物的基础上培养厌氧微生物，撤下曝气设备，停止曝气，配水浓度增大到大于1000mg/L，测试进出水C0D，10天以后厌氧细菌培养结束。
[0096]实验所使用的复合菌种的混合重量比、接种量的数值如表1-2所示。
[0097]本发明所述的微生物制剂的好氧、厌氧挂膜天数如表3所示。
[0098]表1，实验用多菌种接种重量比例列表
[0099]
【权利要求】
1.一种具有高生物膜挂膜效率的微生物制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤包括: 步骤1，枯草芽孢杆菌、硝化刺菌、反硝化短枝单胞菌分别单独进行好氧通气发酵培养得菌剂，沼泽红假单胞菌进行厌氧光照发酵培养得菌剂； 步骤2，将步骤I得到的各菌剂混合，得所需的生物制剂，其中，各菌剂混合的重量比例为枯草芽孢杆菌菌剂5-30%、沼泽红假单胞菌菌剂10-40%、硝化刺菌菌剂10-60%、反硝化短枝单胞菌菌剂10-40%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述枯草芽孢杆菌好氧通气发酵培养过程中的培养基，按照重量百分配比，包括:豆柏粉2.0-3.5%、蛋白胨0-1.0%、玉米粉3-4%、葡萄糖0-4%、磷酸氢二钠0-1%、磷酸二氢钾0_1%、硫酸铵0_2%、尿素0_1%、水82.5-95%。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的枯草芽孢杆菌与培养基混合的重量比为1-10:90-99，好氧通气发酵的温度为30-39°C，时间为1_3天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的沼泽红假单胞菌厌氧光照发酵培养过程中的培养基，按照重量百分配比，包括:酵母粉1_2%、乙酸钠1-5%、硫酸铵1_3%、磷酸二氢钾0-1%、硫酸镁0-1%、氯化钠0.5-1%、水87-99.2%。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的沼泽红假单胞菌与培养基混合的重量比为1-15:85-99，厌氧光照发酵的温度为30-38°C，时间为2_10天。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的硝化刺菌厌氧光照发酵培养过程中的培养基，按照重量百分配比，包括:碳酸氢钠0.1-0.5%、亚硝酸钠`0.1-0.5%、碳酸钠 0.1-0.5%、磷酸二氢钾 0-1%、硫酸镁 0-1%、氯化钠 0.5_1%、水 95.5-96.5%。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的硝化刺菌与培养基混合的重量比为3-12:90-99，好氧通气发酵的温度为25-35°C，时间为2_7天。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的反硝化短枝单胞菌好氧通气发酵培养过程中的培养基按照重量百分配比，包括:醋酸钠0.01-0.05%、硝酸钾0.01-0.05%、磷酸二氢钾 0.001-0.002%、氯化镁 0.001-0.002%、氯化钙 0.001-0.002%、水99.894-99.97%。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的反硝化短枝单胞菌与培养基混合的重量比为1-8:92-99，好氧通气发酵的温度为25-35°C，时间为1_8天。
10.一种采用权利要求1所述的方法制备得到的微生物制剂，其特征在于，包括微生物组分，以微生物组分总量为基准，包括以下重量百分比的菌种: 枯草芽孢杆菌菌剂5-30%、沼泽红假单胞菌菌剂10-40%、硝化刺菌菌剂10-60%、反硝化短枝单胞菌菌剂10-40%。
【文档编号】C12N1/20GK103773713SQ201310671373
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】江瀚, 王戌晋 申请人:上海亘卓生物工程有限公司