对虾桃拉综合症病毒可视化lamp检测试剂及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种对虾桃拉综合症病毒可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法，针对对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列，设计6条特异性扩增引物，扩增引物和反应试剂共同组成LAMP检测液体系，反应试剂包括反应缓冲液Bst?DNA?polymerase?bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、二价锰离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂，余量为水。检测步骤包括：提取待检样品的基因组DNA、配制LAMP检测液体系、反应体系、恒温设备中扩增反应、判断检测结果。本发明的检测方法在敏感性高、特异性强的前提下使用的仪器简单，成本低。
【专利说明】对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环介导等温扩增检测【技术领域】，尤其涉及了对虾桃拉综合症病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测试剂及检测方法。
【背景技术】
[0002]对虾桃拉综合症病毒(TSV)是近年来新发现的一种严重危害养殖对虾的病毒，根据国际病毒分类委员会(ICTV)第7次报告，该病毒属于双顺反子病毒科(Dicistroviridae),蜜蜂麻痹病毒属(Aparavirus)。该病毒主要感染太平洋白奸(Pacificwhite shrimp)、南美白对虫下(Penaaeus vannamei)、太平洋蓝虫下(Pacific blue shrimp)
坐寸ο
[0003]由于TSV危害严重，成为威胁对虾养殖业的主要疾病之一，因此，1995年被国际兽疫局(0ΙΕ)、联合各粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)同时列为必报的水生动物疫病。目前，TSV的检测诊断方法主要包括聚合酶链反应(PCR)检测技术、核酸探针技术和ELISA检测技术等。其中，PCR检测技术以其简便快捷、特异性好、敏感性高等特点被OIE推荐为该病的检测手段之一。
[0004]环介导等温扩增(LAMP)技术是2000年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP则针对靶基因的6个不同区域、同时使用3对引物对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。
[0005]随着新一代生化试剂的不断开发，该技术已实现不开盖就可直接进行可视化检测的水平。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色；或在有钙黄绿素、SYBR Green等颜色指示剂存在的情况下，反应产物呈现出特定的颜色。因此，可以把浑浊度或颜色作为反应的指标，只用肉眼观察到白色浑浊沉淀或特定颜色，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和染色过程。LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。但是，目前尚未见有利用环介导等温扩增(LAMP)对对虾桃拉综合症病毒(TSV)进行检测的报道。本发明根据LAMP技术原理，以TSV基因为模板，通过对反应条件和可视化检测条件进行研究，建立了TSV的可视化LAMP快速检测技术，并在临床样品检测中进行了初步应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种更方便、特异性强、成本低、通过肉眼直接检测荧光来判断结果的对虾桃拉综合症病毒(TSV)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测试剂及检测方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，针对对虾桃拉综合征病毒基因 组保守区的衣壳蛋白基因序列，设计6条特异性扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。
[0008]所述的F3 为 5’ - GGTCCTGGACTTCAAACA -3’ ；
所述的 B3 为 5’ -TTGCGTGGTGGGACTA-3’ ；
所述的 FIP 为 5’ -AGGTTCCACAATCTTGATGAATGAT-CTGTTACATTCTTAGACAGCACTA-3’ ；
所述的 BIP 为 5’ -TCACTGTTAGTAACACTACCTCCT-CCTGCTAACCCAGTCGA-3’ ；
所述的 LF 为 5’ -ATCCCAATCACTAATCAGAATG-3’ ；
所述的 LB 为 5’ -AGTCCTCCACTGGTTGT-3’。
[0009]所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、二价猛离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂，余量为水。
[0010]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的进一步改进，所述的颜色指示剂为1丐黄绿素，或是SYBR Green。
[0011]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的进一步改进，所述的镁离子为MgSO4溶液溶液；所述的二价锰离子为MnCl2溶液。
[0012]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的进一步改进，所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为:F3 0.2 μ mol/L~8 μ mol/L, B3 0.2 μ mol/L~8 μ mol/L, FIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, BIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LF 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LB 0.2 μ mol/L~8 μ mol/L,反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶4U~40U、续离子0.8 mmol/L~10 mmol/L、二价猛离子0.02~1.25 mmol /L、甜菜喊0.04 mmol/L~I mmol/L、脱氧核糖核昔三憐酸dNTPs 0.2 mmol/L~4mmol/L、钙黄绿素25 μ mol/L~125 μ mol/L,或I X~10 X SYBR Green代替钙黄绿素25 μ mol/L~125 μ mol/L。
[0013]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的进一步改进，所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为:F3 0.4 μ mol/L, B3 0.4 μ mol/L, FIP 0.8 μ mol/L，BIP 0.8 μ mol/L, LF 0.4 μ mol/L, LB 0.4 μ mol/L,反应缓冲液 Bst DNA polymerasebuffer I X、链置换 DNA 聚合酶 8U、7mmol/L MgSO4 和 0.08mmol/L MnCl2、甜菜喊 0.2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.6mmol/L、钙黄绿素100 μ mol/L，或4X SYBR Green代替钙黄绿素 100 μ mol/L。
[0014]一种用以上所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，所述检测方法的检测步骤包括:
(1)提取待检样品的总RNA；
(2)配制LAMP检测液体系；
(3)在LAMP检测液体系中加入步骤(1)提取的待检样品总RNA，样品总DNA的量在LAMP检测液体系的含量为0.5~2ul/50ul。
[0015](4)将步骤(3)配制的反应体系混合均匀；
(5)将步骤(4)的反应体系置于恒温设备；
(6)按反应程序进行扩增反应，反 应程序依次为:55°C~70°C30min~120 min，80°C~100°C 5min,10°C 5min ；
(J)反应结束后，根据颜色反应判断检测结果，判断标准为:肉眼直接观察或在紫外光下观察，扩增产物颜色呈现黄绿色荧光的样品判断为样品中存在对虾桃拉综合症病毒，反之扩增产物颜色无变化不存在对虾桃拉综合症病毒。
[0016]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法的进一步改进，所述的配制LAMP检测液体系为设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，所述的F3为5’ - GGTCCTGGACTTCAAACA-3’，所述的 B3 为 5’ -TTGCGTGGTGGGACTA-3’，所述的 FIP 为 5’ -AGGTTCCACAATCTTGATGAATGAT-CTGTTACATTCTTAGACAGCACTA-3’ ，所述的 BIP 为 5’-TCACTGTTAGTAACACTACCTCCT-CCTGCTAACCCAGTCGA-3’，所述的 LF 为 5’ -ATCCCAATCACTAATCAGAATG-3’，所述的 LB 为5’ -AGTCCTCCACTGGTTGT-3’，然后在LAMP扩增引物中加入反应试剂；所述扩增引物在LAMP检测液体系中的浓度为:F3 0.2ymol/L ~8ymol/L，B3 0.2 μ mol/L ~8ymol/L，FIP0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, BIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LF 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LB0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L。
[0017]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法的进一步改进，所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶4U ~40U、续离子 0.8 mmol/L ~10 mmol/L、二价猛离子 0.02 ~1.25 mmol/L、甜菜喊0.04 mmol/L ~I mmol/L、脱氧核糖核苷三憐酸 dNTPs 0.2 mmol/L ~黄绿素25 μ mol/L ~125 μ mol/L,或 I X ~10 X SYBR Green代替钙黄绿素 25 μ mol/L ~125 μ mol/L ;所述扩增引物在LAMP检测液体系中的浓度为:反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferI X、链置换 DNA 聚合酶 8U、7mmol/L MgSO4 和 0.08mmol/L MnCl2、甜菜喊 0.2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.6mmol/L、钙黄绿素100 μ mol/L,或4X SYBR Green代替钙黄绿素100 μ mol/L。
[0018]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法的进一步改进，所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶8U、7mmol/L MgSO4 和 0.08mmo1 /T, MnCl2、甜菜喊 0.2mmol/L、脱氧核糖核昔三憐酸 dNTPs0.6mmol/L、钙黄绿素 100 μ mol/L，或 4X SYBR Green 代替钙黄绿素 100 μ mol/L。
[0019]作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法的进一步改进，所述的反应程序依次为:60°C `60min,80°C 5min, 10°C 5min。
[0020]作为本发明的进一步限定，本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂、用对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，应用于检测对虾桃拉综合症病毒。
[0021]在上述检测方法中，如果使用钙黄绿素作为颜色指示剂，则钙黄绿素作为反应试剂中的一种，与其他反应试剂同时加入反应；如果使用SYBR Green作为颜色指示剂，则是在样品与其他反应试剂反应结束后，再加入SYBR Green，进行颜色反应标识。即若使用钙黄绿素作为颜色指示剂，在反应结束后，直接根据颜色反应判断检测结果；若使用SYBR Green代替钙黄绿素，则在反应结束后，在扩增产物中加入SYBR Green，再根据颜色反应判断检测结果。
[0022]与现有技术相比，本发明的优点:
1.检测操作简单方便，成本低，适用于更多的基层单位。本发明的检测方法，不需要专门的技术人员全程操作，而且使用的仪器简单，如干式恒温仪、水浴锅等就可以了，也可以在基因扩增仪上进行基因扩增，通过肉眼直接观察颜色或荧光就可对结果进行判断。与PCR技术一样，LAMP也是一种基于核酸模板的基因扩增技术,但两者也存在差异。其中，PCR只使用一对分别针对靶基因两端的特异性引物，利用耐热性Taq DNA聚合酶，通过变性、退火、延伸三个步骤循环往复对目的片段进行扩增，最后利用电泳技术分析结果；而LAMP使用3对分别针对靶基因的6个区域、包含4种特性的特异性引物，利用Bst DNA聚合酶进行恒温扩增，扩增产物直接通过肉眼或借助浊度仪分析结果。与PCR技术相比，LAMP在疾病诊断方面具有更简便快速、灵敏特异的优势。
[0023]2.敏感性高，特异性强。本发明TSV-LAMP最低可检测到IOfg的TSV阳性质粒DNA模板，与TSV RT-PCR检测技术的Ipg最低检测量相比，灵敏度提高了 10倍，本技术更适合于TSV感染量较低或病毒感染初期的样品检测，这在虾苗引种和无特定病原体(SPF)种虾群培育以及对虾无公害健康养殖生产中均有着十分重要的意义。高度灵敏的TSV-LAMP检测技术可以在一定程度上避免了由于病毒含量较低而导致的假阴性结果而导致的漏诊，提高检测结果的准确性，把病毒感染的威胁降低到最低。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是可视化LAMP特异性试验结果图:
1-1为含有对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列质粒，1-2、1-3、1-4为含有对虾桃拉综合症病毒的样品总RNA，1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10分别为溶藻弧菌、大肠杆菌、IHHNV感染的对虾样品、WSSV感染的对虾样品、SPF种虾组织样品的总RNA以及空白对照dH20。
[0025]图2是可视化LAMP敏感性试验结果图:
2-1为dH20空白对照；2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8的反应体系中含有对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列质粒量分别为lng、100 pg、10 pg、l pg、100
fg、10 fg、l fgo
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明进一步说明。
[0027]实施例1:特异性试验
步骤(1)样品RNA提取:取对虾的肝胰腺、鳃、肌肉组织等共约100 mg进行组织匀浆，从中再取适量样品，利用Trizol RNA提取试剂(美国GIBCOBRL公司)抽提对虾总RNA，置于-20°C保存备用。
[0028]步骤(2) LAMP检测液体系配制
①:针对对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列，设计6条特异性扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。
[0029]F3 为 5，- GGTCCTGGACTTCAAACA -3，；
B3 为 5’-TTGCGTGGTGGGACTA-3’ ；
FIP 为 5’-AGGTTCCACAATCTTGATGAATGAT-CTGTTACATTCTTAGACAGCACTA-3’ ；
BIP 为 5’-TCACTGTTAGTAACACTACCTCCT-CCTGCTAACCCAGTCGA-3’ ；
LF 为 5’-ATCCCAATCACTAATCAGAATG-3’ ；
LB 为 5’-AGTCCTCCACTGGTTGT-3’ 。[0030]反应试剂:反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、二价锰离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂，余量为水。
[0031 ] ②在PCR管中，依次加入上述对虾桃拉综合征病毒LAMP检测液体系所需的各种试剂，试剂的加入量和浓度分别如下:
l.0yL 10 μ mol/L 的 F3 (终浓度 0.4 μ mol/L), l.0yL 10 μ mol/L 的 B3 (终浓度0.4 μ mol/L), 2.0 μ L 10 μ mol/L 的 FIP(终浓度 0.8 μ mol/L), 2.0 μ L 10 μ mol/L 的 BIP(终浓度 0.8 μ mol/L), l.0yL 10 μ mol/L LF(终浓度 0.4 μ mol/L), l.0yL 10 μ mol/L 的LB (终浓度 0.4 μ mol/L), 2.5 μ L 10 X 反应缓冲液 Bst DNA polymerase bufferr (终浓度I X )，5 μ L 40U/ μ L的链置换DNA聚合酶(终浓度8U)，2.5 μ L 70mmol/L的MgSO4(终浓度 7mmol/L), IuL 2mmol/L 的 MnCl2(终浓度 0.08mmol/L), I μ L 5mmol/L 的甜菜喊(终浓度0.2mmol/L), IyL 15 mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs (终浓度0.6mmol/L), 2 μ L1250 μ mol/L钙黄绿素(终浓度100 μ mol/L)，或Iul 10 X SYBR Green代替钙黄绿素，用灭菌dH20补足反应总体积至25ul。
[0032]步骤(3)在LAMP检测液体系加入提取的待检样品总RNA 2 μ L，4份已由RT-PCR方法或测序方法验证为含有对虾桃拉综合症病毒的样品总RNA ；5份已由RT-PCR方法或测序方法验证为不含有对虾桃拉综合症病毒的其它对照样品核酸样品总RNA，包括溶藻弧菌、大肠杆菌、IHHNV感染的对虾样品、WSSV感染的对虾样品、SPF种虾组织样品。试验同时设立空白对照1份，以dH20代替RNA作为模板。
[0033]将上述 配制好的含LAMP反应体系的PCR反应管置于恒温水浴锅，设定反应程序进行扩增反应，反应程序为:60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。
[0034]步骤(4)结果判定
反应结束后，根据反应管颜色判定结果:
①直接用肉眼观察反应液的颜色变化，扩增产物颜色呈现黄绿色荧光的样品判断为样品中存在对虾桃拉综合症病毒(用“ + ”表示)，反之扩增产物颜色无变化不存在对虾桃拉综合症病毒(用表示)。
[0035]②在紫外光下用肉眼观察反应液的颜色变化，扩增产物颜色呈现黄绿色荧光的样品判断为样品中存在对虾桃拉综合症病毒(用“ + ”表示)，反之扩增产物颜色无变化不存在对虾桃拉综合症病毒(用表示)。
[0036]如图1所示，为本实施例的检测结果，样品1-1为含有对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列质粒，1-2、1-3、1-4为含有对虾桃拉综合症病毒的样品总RNA的检测结果，其肉眼观察(紫外线下肉眼观察)扩增产物颜色呈现黄绿色荧光，样品检测结果为“ + 样品1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10分别为溶藻弧菌、大肠杆菌、IHHNV感染的对虾样品、WSSV感染的对虾样品、SPF种虾组织样品的总RNA以及空白对照dH20的检测结果，其肉眼观察(紫外线下肉眼观察)扩增产物颜色无变化，样品检测结果为本实施例检测结果与预期(由RT-PCR方法或测序方法验证)一致，符合率为100%。
[0037]实施例2:特异性试验
本实施例与实施例1的区别在于步骤步骤(2)LAMP检测液体系配制中对虾桃拉综合征病毒LAMP检测液体系所需的各种试剂，试剂的加入量和浓度分别如下:
0.5 μ L 10 μ mol/L 的 F3 (终浓度 0.2 μ mol/L), 0.5 μ L 10 μ mol/L 的 Β3 (终浓度0.2ymol/L),2.Ομ L IOO μ mol/L 的 FIP(终浓度 8 μ mol/L)，2.0 μ L 100 μ mol/L 的 BIP(终浓度 8 μ mol/L), 0.5 μ L 10 μ mol/L LF (终浓度 0.2 μ mol/L), 0.5 μ L 10 μ mol/L 的LB (终浓度 0.2 μ mol/L), 2.5 μ L 10 X 反应缓冲液 Bst DNA polymerase bufferr (终浓度I X )，2.5 μ L 40U/ μ L 的链置换 DNA 聚合酶(终浓度 4U)，2.5 μ L IOOmmoI/L 的 MgSO4 (终浓度 10mmol /I,), 0.5 μ L I mmol/L 的 MnCl2 (终浓度 0.02mmol/L), IyL 2 Smmol /I,的甜菜碱(终浓度1.0mmol/L), IyL 5 mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs (终浓度0.2mmol/L),luL 625 μ mol/L 钙黄绿素(终浓度 25 μ mol/L)，或 Iul 100 X SYBR Green 代替钙黄绿素，用灭菌dH20补足反应总体积至25ul。
[0038] 步骤(3)中恒温反应反应程序为:55°C120min, IOO0C 5min, 10°C 5min。
[0039]其余步骤与实施例1相同。检测结果与实施例1相同，同图1。
[0040]实施例3:特异性试验
本实施例与实施例1的区别在于步骤步骤(2)LAMP检测液体系配制中对虾桃拉综合征病毒LAMP检测液体系所需的各种试剂，试剂的加入量和浓度分别如下:
LOyL 200 μ mol/L 的 F3 (终浓度 8 μ mol/L), l.0yL 200 μ mol/L 的 B3 (终浓度8 μ mol/L), 2.0 μ L 2.5 μ mol/L 的 FIP(终浓度 0.2 μ mol/L), 2.0 μ L 2.5 μ mol/L 的 BIP(终浓度 0.2 μ mol/L), l.0yL 200 μ mol/L LF(终浓度 8 μ mol/L), l.0yL 200 μ mol/L 的LB (终浓度 8 μ mol/L), 2.5 μ L 10 X 反应缓冲液 Bst DNA polymerase bufferr (终浓度I X )，2.5 μ L 40U/ μ L 的链置换 DNA 聚合酶(终浓度 4U)，1.0 μ L 20mmol/L 的 MgSO4(终浓度 0.8mmol/L), 1.25 μ L 25mmol/L 的 MnCl2 (终浓度 1.25mmol/L), IyL I mmol/L 的甜菜碱(终浓度0.04mmol/L),4yL 25 mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs(终浓度4.0mmol/L),2.5μ L 125(^11101/1钙黄绿素(终浓度125 4 11101/1)，或0.5111 10XSYBR Green 代替钙黄绿素，用灭菌dH20补足反应总体积至25ul。
[0041]步骤(3)中恒温反应反应程序为:70°C30min,80°C 5min, 10°C 5min。
[0042]其余步骤与实施例1相同。检测结果与实施例1相同，同图1。
[0043]实施例4:可视化LAMP敏感性试验
本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)在LAMP检测液体系中模板加入量为2ul，分别为不同量梯度的含有对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列质粒7组；试验同时设立空白对照1份，以dH20代替RNA作为模板。其余步骤相同。
[0044]如图2所示为本实施例的检测结果，其中2-1为dH20空白对照，其肉眼观察(紫外线下肉眼观察)扩增产物颜色无变化，样品检测结果为“-”;2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8的反应体系中质粒量分别为lng、100 pg、10 pg、l pg、100 fg、10 fg、l fg,其肉眼观察(紫外线下肉眼观察)扩增产物颜色呈现黄绿色荧光，样品检测结果为“ + ” ;本实施例检测结果与预期(由RT-PCR方法或测序方法验证2-2、2-3、2-4、2-5为显黄绿色荧光)一致，而RT-PCR方法或测序方法无法检验到2-6、2-7中含有对虾桃拉综合征病毒质粒。结果表明:本发明TSV-LAMP最低可检测到IOfg的TSV阳性质粒DNA模板，与TSV RT-PCR检测技术的Ipg最低检测量相比，灵敏度提高了 10倍。
[0045]实施例5:可视化LAMP临床检测试验
本发明TSV-LAMP方法和WSS-PCR同时对250份对虾样品进行检测，结果，TSV-LAMP和TSV-PCR均同时检测到9份相同标记样品含有对虾桃拉综合征病毒，两种方法检测结果符合率为100%。说明本发明方法与RT-PCR方法一样适用于临床样品检测。本方法基因扩增后无需作进一步的电泳分析，比RT-PCR`方法更简便，更适合于生产上现场操作。
【权利要求】
1.对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，其特征在于:针对对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列，设计6条特异性扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，所述的F3为5’ - GGTCCTGGACTTCAAACA-3’，所述的 B3 为 5’ -TTGCGTGGTGGGACTA-3’，所述的 FIP 为 5’ -AGGTTCCACAATCTTGATGAATGAT-CTGTTACATTCTTAGACAGCACTA-3’ ，所述的 BIP 为 5’-TCACTGTTAGTAACACTACCTCCT-CCTGCTAACCCAGTCGA-3’，所述的 LF 为 5’ -ATCCCAATCACTAATCAGAATG-3’，所述的 LB 为5’-AGTCCTCCACTGGTTGT-3’ ； 所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerasebufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、二价锰离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂，余量为水。
2.根据权利要求1所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，其特征在于:所述的颜色指示剂为1丐黄绿素，或是SYBR Green。
3.根据权利要求1所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，其特征在于:所述的镁离子为MgSO4溶液；所述的二价锰离子为MnCl2溶液。
4.根据权利要求1或2或3任一项所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，其特征在于:所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为:F3 0.2μπι01/1~8 μ mol/L, B3 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, FIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, BIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LF 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LB 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L,反应缓冲液 Bst DNApolymerase buffer IX、链置换 DNA 聚合酶 4U ~40U、续离子 0.8 mmol /I,~10 mmol /L、二价猛离子0.02~1.25 mmol/L、甜菜碱0.04 mmol/L~I mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸 dNTPs 0.2 臟01/1~4臟01/1、钙黄绿素25 4 11101/1~125 4 11101/1，或1\ ~10XSYBRGreen 代替|丐黄绿素 25 μ mol/L ~125 μ mol/L。
5.根据权利要求4所述 的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，其特征在于:所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为:F3 0.4 μ mol/L, B3 0.4 μ mol/L,FIP 0.8 μ mol/L, BIP 0.8 μ mol/L, LF 0.4 μ mol/L, LB 0.4 μ mol/L，反应缓冲液 Bst DNApolymerase buffer I X、链置换 DNA 聚合酶 8U、7mmol/L MgS04、0.08mmol/L MnCl2、甜菜碱0.2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.6mmol/L、钙黄绿素100 μ mol/L，或4X SYBRGreen代替|丐黄绿素100 μ mol/L。
6.一种用权利要求1~5任一所述的对奸桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，其特征在于:所述检测方法的检测步骤包括: (1)提取待检样品的基因组DNA； (2)配制LAMP检测液体系； (3)在LAMP检测液体系中加入步骤(1)提取的待检样品基因组DNA； (4)将步骤(3)配制的反应体系混合均匀； (5)将步骤(4)的反应体系置于恒温设备； (6)按反应程序进行扩增反应，反应程序依次为:55°C~70°C30min~120 min，80°C~100°C 5min,10°C 5min ； (7)反应结束后，根据颜色反应判断检测结果，判断标准为:肉眼直接观察或在紫外光下观察，扩增产物颜色呈现黄绿色荧光的样品判断为样品中存在对虾桃拉综合症病毒，反之扩增产物颜色无变化不存在对虾桃拉综合症病毒。
7.根据权利要求6所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，其特征在于:所述的配制LAMP检测液体系为设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环弓丨物LF和LB，所述的F3为5’ -GGTCCTGGACTTCAAACA -3’，所述的 B3 为 5’ -TTGCGTGGTGGGACTA-3’，所述的 FIP 为 5’ -AGGTTCCACAATCTTGATGAATGAT-CTGTTACATTCTTAGACAGCACTA-3’，所述的 BIP 为 5’ -TCACTGTTAGTAACACTACCTCCT-CCTGCTAACCCAGTCGA-3’，所述的 LF 为 5’ -ATCCCAATCACTAATCAGAATG-3’，所述的LB为5’ -AGTCCTCCACTGGTTGT-3’，然后在LAMP扩增引物中加入反应试剂；所述扩增引物在 LAMP 检测液体系中的浓度为:F3 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, B3 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, FIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, BIP 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LF 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L, LB 0.2 μ mol/L ~8 μ mol/L。
8.根据权利要求7所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，其特征在于:所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶4U~40U、续离子0.8 mmol/L~10 mmol/L、二价猛离子0.02~1.25 mmol/L、甜菜喊0.04 mmol/L ~I mmol/L、脱氧核糖核苷三憐酸 dNTPs 0.2 mmol/L ~黄绿素25 μ mol/L ~125 μ mol/L,或 I X ~10 X SYBR Green代替钙黄绿素 25 μ mol/L ~125 μ mol/L ;所述扩增引物在LAMP检测液体系中的浓度为:反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferI X、链置换 DNA 聚合酶 8U、7mmol/L MgSO4 和 0.08mmol/L MnCl2、甜菜喊 0.2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.6mmol/L、钙黄绿素100 μ mol/L,或4X SYBR Green代替钙黄绿素100 μ mol/L。`
9.根据权利要求8所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，其特征在于:所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶 8U、7mmol/L MgS04、0.08mmol/L MnCl2Jf 菜喊 0.2mmol/L、脱氧核糖核苷三憐酸 dNTPs0.6mmol/L、钙黄绿素 100 μ mol/L，或 4X SYBR Green 代替钙黄绿素 100 μ mol/L。
10.根据权利要求6所述的对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的检测方法，其特征在于:所述的反应程序依次为:60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103820570SQ201310674095
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】谢芝勋, 庞耀珊, 谢丽基, 谢志勤, 邓显文, 刘加波, 范晴, 罗思思 申请人:广西壮族自治区兽医研究所