一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，属于酶制剂加工领域。所述啤酒复合酶以天然浓缩麦芽酶为主要原料，科学复配混合酶，不仅补充了充足的酶源，更重要的是在保护剂和激活剂协同作用下，其酶活力更足、保存性能更优、氮源更丰富、麦芽香味更足，常温保存2年酶活损失率在3%以下，混合酶中的中性蛋白酶以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵而制备的中性蛋白酶酶活力为5500-7000U/mL；最适反应温度70℃，最适反应pH值为7.2，更加适合啤酒酿造。本发明复配科学，产品功能齐全，保质期长，便于运输、贮藏和使用，为生产优质啤酒奠定了基础。
【专利说明】一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂加工领域，具体是一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶。
【背景技术】
[0002]啤酒营养丰富，酒精含量低，以其特有的泡沫和特殊的香味，深受广大消费者喜爱，啤酒中含有人体必须的维生素、氨基酸和碳水化合物等营养物质，适量的饮用啤酒有利于人体健康，故享有“液体面包”的美名。
[0003]我国啤酒业发展迅速，啤酒产量已连续几年位居世界首位，但遗憾的是，国产大麦的发展却出现了徘徊不前的窘况。其根本原因是受土质、气候、品种、发芽方法、工艺条件等的制约，国产麦芽的品质一直较低。大的啤酒集团不惜高价进口一类澳麦和法麦为啤酒生产原料，国产大麦由于受诸多因素影响，本身的淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶、氧化还原酶等在发芽过程中分泌不足，导致啤酒麦芽中β_葡聚糖、半纤维素、蛋白质等含量过高,造成糖化后麦汁质量和产量双低,不能生产高端啤酒。
[0004]随着各种啤酒原料价格的不断上涨，特别是进口麦芽、大米价格的直线上扬，直接导致了啤酒生产成本的大幅上升。为维持企业的生存和发展，各个啤酒厂加都在积极应对此项问题，通过技术创新和提高辅料比例来消化成本上升的压力，在这种形势下，原料中添加小麦芽及淀粉质辅料成为啤酒企业的主要选择。
[0005]在大麦芽质量较差以及添加淀粉质辅料较多的情况时，酶制剂的添加成为一种必要。目前，酶制剂市场啤酒复合酶种类较多，按照添加工序来分有糖化工序、发酵工序、过滤工序及灌装工序啤酒复合酶，以糖化工序添加的复合酶较多，其主要的复配原则是以啤酒麦芽酶系为基础进行淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶、氧化还原酶等酶制剂的优化组合，成功解决了因为麦芽质量差或辅料添加量高而引起的糖化不完全、浸出率低，麦汁粘度大、过滤困难，蛋白质溶解不充分、α -氨基氮含量低等麦汁制造难题。
[0006]但是，当啤酒酿造过程中为了降低生产成本，提高辅料使用比例时，虽然添加外加酶制剂糖化可有效改善啤酒口味，降低色度、总酚，延长啤酒保质期，但同时也会产生许多负面影响，如氮源不足、过滤困难、非生物稳定性降低等，造成酿制出的啤酒氨基酸水平低、营养价值不高，啤酒的泡沫性能差、泡沫不丰富，麦芽香味不足等质量缺陷，失去了传统啤酒的本质口感和风味，称不上真正意义的啤酒。为此大多数啤酒生产厂家通过添加不同的食品添加剂试图解决上述质量问题但效果仍不理想。
[0007]如何在提高辅料比例，降低啤酒生产成本的同时，生产出营养价值丰富、口感和风味天然纯正的优质传统啤酒是目前啤酒生产厂家共同的追求和期望。
【发明内容】
[0008]本发明所解决的技术问题是克服了现有啤酒复合酶复配简单、功能单一、使用时酶活力不足及运输、贮藏和使用过程中容易失活等缺陷，以优质进口麦芽为原料，采用超声波、高压脉冲电场技术(pulsed electric field简称“PEF”)最大限度的提取麦芽酶系酶源，进行过滤、超滤浓缩、喷雾干燥制得浓缩麦芽酶；同时，以优质麦芽为原料，通过酶解、过滤、超滤浓缩制得浓缩麦汁粉；最后以麦芽酶为主要原料科学复配混合酶、浓缩麦汁粉、保护剂、激活剂等制得一种麦芽酶系全、酶活力强、不易失活、麦芽香味浓、可为麦汁提供丰富氮源的啤酒复合酶。
[0009]为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案:
[0010]一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶由以下重量份数的原料组成:
[0011]浓缩麦芽酶40-60份，混和酶30-40份，浓缩麦汁粉10_20份，保护剂10_15份，激活剂10-15份。
[0012]所述混和酶是由如下质量份数的酶制剂均匀混合而成:
[0013]淀粉酶15-35份，蛋白酶15-30份，半纤维素酶15-30份，酯酶10-15份。
[0014]所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0015]30%真菌α -淀粉酶，30%葡萄糖酶(糖化酶)，15% β -淀粉酶，15%普鲁兰酶，10%中温α -淀粉酶。
[0016]所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0017]30%木瓜蛋白酶，20%中性蛋白酶，20%酸性蛋白酶，10%菠萝蛋白酶，10%脯氨酸蛋白酶，10%无花果蛋白酶。
[0018]所述中性蛋白酶 的制备方法包括以下步骤:
[0019](I)菌种活化
[0020]将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，30_36°C培养24-36h进行菌种活化，如此活化2-3次；
[0021]所述斜面培养基组成为:牛肉膏3-10g，氯化钠5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，琼脂 15_20g，中草药粉剂 5-10g,蒸馏水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C灭菌 20min ；
[0022]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0023]称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10_15份；黄芩10_15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度700C _90°C保持2-4h，然后降温至45-60°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至600C _78°C保持3-4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0024]所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10%。
[0025]所述混合酶的重量份数组成为:内β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0026]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
[0027](2)液体种子扩大培养
[0028]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30-36°C，培养时间10_15h ；
[0029]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0030]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30-36°C，培养时间10_15h ；
[0031]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30-36°C，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V) 1:1-2,罐压0.05Mpa,培养时间 10-20h ；
[0032]所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为:
[0033]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸钙Ig,氯化镁2g,柠檬酸钠l_3g，不足部分纯净水补足，pH 值 7.0-7.2，121-123°C灭菌 30_40min。
[0034]所述种子罐培养基重量百分比组成为:
[0035]麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药粉剂1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆 0.1-0.5%，磷酸氢二钾 0.8-1.5%，硫酸镁 0.05-0.1%，柠檬酸钠 0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123°C灭菌30_40min。
[0036]所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml ；
[0037](3)发酵罐发酵 [0038]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度30_36°C，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后以1-2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2_5°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1-2°C /h升温速率缓慢升温至10_15°C，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h升温速率缓慢升温至30-36 °C，恒温培养 15-20h ；
[0039]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30% ；
[0040]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.0-7.2 ；
[0041]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0042]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0043]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆饼粉15_25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，柠檬酸钠l_5g，消泡剂0.Ι-lg,纯净水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C灭菌 20min ；
[0044]所述补料培养基重量百分比组成为:麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，中草药剂粉5-10%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121_123°C灭菌30_40min。
[0045]所述发酵培养基的调配方法为:
[0046]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0-7.2，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温15-30min，然后缓慢升温至90°C保温15_30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0-7.2，121-123°C灭菌30_40min备用。
[0047](4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶。
[0048]所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药粉剂。[0049]所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0050]40%耐温葡聚糖复合酶，30% β-葡聚糖复合酶，10%甘露聚糖酶，10%的木聚糖酶，
[0051]10%的戊聚糖酶。
[0052]所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0053]50%酸性磷酸酶，30%脂肪酶，20%磷酸酯酶。
[0054]所述浓缩麦芽酶重量百分比组成为:原麦芽酶80-85%，香味麦芽酶15-20%。
[0055]所述原麦芽酶制备方法如下:
[0056](I)高压脉冲电场(PEF)浸泡处理:将麦芽在预浸槽中用3-6倍20_50°C温水浸泡10-20min，使麦芽水分含量达到25_35%，同时进行高压脉冲电场(PEF)处理，电场强度20-40KV/cm，脉冲时间 150-200 μ S，脉冲频率 200_300Ηζ ；
[0057](2)粉碎:将步骤(1)中处理好的麦芽与浸泡水加入麦芽粉碎机带水粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到麦芽浆液；
[0058](3)超声、PEF提取:将麦芽浆液置于配料缸中，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度0.6A/25w-1.5A/275w条件下进行超声提取10_15min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取15-20min,电场强度20-40KV/cm,脉冲时间400-600 μ S，脉冲频率200-300Ηζ ；
[0059](4)过滤:将提取液于室温用500-800目滤布预涂粒度为100目-300目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14-0.24Mpa ；
[0060](5)超滤浓缩:采用截留分子量〈100000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的10-15倍；
[0061](6)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量3-5%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150-160°C，排风温度75-85°C，干燥时间5_15s，产品水分
<5%，既得原麦芽酶。
[0062]所述香味麦芽酶制备方法如下:
[0063](I)麦芽回潮:用麦芽重量3-4%，温度为40_50°C温水均匀喷雾麦芽粒表面，置混合机中均匀混合3-5min。
[0064](2)烘焙:将回潮麦芽装入转筒式炒炉，在10_15min内温度升至170-200°C，保温10-15min，然后降温至100_110°C，保温20_30min，最后取出摊凉，得到香味麦芽；
[0065](3)粉碎:将香味麦芽加入麦芽粉碎机粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到香味麦芽粉；
[0066](4)超声、PEF提取:将香味麦芽粉置于配料缸中，加入3-6倍的水，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度0.6A/25w-l.5A/275W条件下进行超声提取10_15min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取15-20min，电场强度20_40KV/cm，脉冲时间400-600 μ S，脉冲频率 200-300Ηζ ；
[0067](5)过滤:将提取液于室温用500-800目滤布采用板框过滤机进行过滤，操作压力为 0.14-0.24Mpa ；
[0068](6)超滤浓缩:采用截留分子量〈100000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的10-15倍；[0069](7)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量3-5%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150-160°C，排风温度75-85°C，干燥时间5_15s，产品水分
<5%，既得香味麦芽酶。
[0070]所述浓缩麦汁粉制备方法如下:
[0071](I)将麦芽粉碎，加入4-5倍的温水，用乳酸调节PH值为4.5-5.5，加入本发明的混合酶进行分段酶解，45-55 °C蛋白休止90min，62-66 °C糖化60min。
[0072](2)待糖化完全，将糖化醪液于74-76°C用500-800目滤布预涂粒度为100目-300目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14-0.24Mpa，过滤得原麦汁；
[0073](3)将原麦汁采用截留分子量〈100000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液浓度为超滤前的10-15倍；
[0074](4)将浓缩液用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150_160°C，排风温度75-850C，干燥时间5-15s，产品水分< 5%，既得浓缩麦汁粉。
[0075]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:
[0076]氯化锌30-40份，氯化钙10-20份，硫酸钠10_20份，氯化镁5_10份。
[0077]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:
[0078]灵芝多糖20-30 份，海藻多糖20-30份，NaC110_20份，(NH4) S0410-15份，半胱氨酸10-15份。
[0079]本发明啤酒复合酶的制备方法:
[0080]将所述保护剂超微粉碎，确保粒度小于所述浓缩麦芽酶及混合酶，随后立即加入浓缩麦芽酶及混合酶，混合均匀，最后加入所述浓缩麦汁粉及激活剂，混合均匀后密封包装即得。
[0081]使用方法:
[0082]糖化阶段将本发明啤酒复合酶制剂加入糖化锅
[0083]添加量:根据麦芽质量的不同和酿造辅料的比例高低，添加量为麦芽干重的
0.06-0.08% ；
[0084]作用条件:最适PH值4.5-5.5 ;最适温度35-65 °C ;最佳料水质量比1:4.5-5.5。
[0085]首先准确称量啤酒复合酶，加入5倍的50_60°C糖化用水于不锈钢容器内，充分搅拌溶解5min，在糖化锅投料前5-10min加入糖化锅，然后开启糖化锅搅拌lOmin，进行正常
糖化工艺。
[0086]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12是由实验室保藏的一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1398_2经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得。
[0087]本发明提供的产强热稳定性中性蛋白酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌1398-2-12。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址:中国.武汉.武汉大学，邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M2013539，分类命名:枯草芽孢杆菌1398-2-12 (Bacillus subtilisl398_2_12)。
[0088]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12具有所产中性蛋白酶耐受温度高、适用pH值范围宽泛的特点，发酵液粗酶液75°C酶活完全稳定，最适反应温度70°C，pH值4.5-8.5酶活稳定，最适反应pH值7.2。该菌株最适生长PH值7.0-7.2，最适生长温度30-36°C，最适产酶温度32-35 °C。
[0089]有益效果:
[0090]1.本发明啤酒复合酶中的中性蛋白酶以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种和适时补料，使得本发明所产中性蛋白酶热稳定性强，酶活力较高，更适应工业化需求。本发明所产中性蛋白酶耐受温度高、适用PH值范围宽泛，发酵液粗酶液75°C酶活完全稳定，最适反应温度70°C，pH值4.5-8.5酶活稳定，最适反应pH值
7.2。更加适合啤酒酿造，能够彻底分解麦芽及辅料中的大分子蛋白，提高啤酒泡沫性能和非生物稳定性，延长啤酒的保质期。
[0091]2.本发明啤酒复合酶中的浓缩麦芽酶以优质进口麦芽为原料，采用超声波、高压脉冲电场技术(pulsed electric field简称“PEF”)等方法最大限度的提取麦芽酶系酶源，是一种天然的啤酒复合酶，其酶源品种及单酶特性100%来自啤酒麦芽，酶解效果、风味和糖化后的麦汁组成远远优于采用微生物发酵制得的单酶及其组合；其中的香味麦芽酶不仅可以提供酶源，最主要的是其浓郁、独特的麦芽香味为高比例辅料外加酶制剂酿造啤酒提供了最天然、纯正的麦芽香味。
[0092]3.本发明啤酒复合酶中的浓缩麦汁粉，将纯正麦汁浓缩，为高比例辅料外加酶制剂酿造啤酒提供了丰富的麦汁氮源。
[0093]4.本发明啤酒复合酶中的保护剂采用多糖、无机盐和氨基酸科学复配，有效减缓了香味麦芽酶及复合酶制剂的回潮；同时可增强复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20-30°C，耐冷冻温度可降低10-15摄氏度，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复合酶的保质期，达到同样的酶活力，同类产品保质期可延长2-3年。
[0094]5.本发明啤酒复合酶添加无机盐作为激活剂，创造了酶催化作用的最佳条件，充分发挥了麦芽中自带酶和外加酶的活力，彻底有效的分解了麦芽中淀粉、蛋白质、半纤维素、脂肪等大分子物质，使得糖化麦汁组分更科学、更合理，不但提高了啤酒的产量，而且大大提高了啤酒的非生物稳定性，同时也促进了酵母的发酵性能。
[0095]6.本发明的啤酒复合酶以天然浓缩麦芽酶为主要原料，科学复配混合酶，不仅补充了充足的酶源，更重要的是在保护剂和激活剂协同作用下，其酶活力更足、保存性能更优、氮源更丰富、麦芽香味更足，为高辅料比例进行外加酶制剂糖化，降低啤酒生产成本，生产出营养价值丰富、口感和风味天然纯正的优质传统啤酒奠定了坚实的基础。
[0096]7.麦芽中的麦芽酶系绝大多数存在于麦芽胚乳细胞的糊粉层，高压脉冲电场(pulsedelectric field简称“PEF”)产生磁场,这种脉冲电场和脉冲磁场交替作用，使胚乳细胞膜及糊粉层透性增加，振荡加剧，胚乳细胞膜及糊粉层强度减弱，因而胚乳细胞膜及糊粉层被破坏，胚乳细胞膜及糊粉层内大量麦芽源酶容易流出，提高了麦芽源酶的浸出率，同时高压脉冲电场可通过电离作用和交替作用杀死溶解、提取过程中的杂菌，有效防止麦芽汁变质。
【具体实施方式】
[0097]下面通过具体的实施方案叙述本发明的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0098]实施例1
[0099]一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶由以下重量份数的原料组成:
[0100]浓缩麦芽酶40份，混和酶30份，浓缩麦汁粉10份，保护剂10份，激活剂10份。
[0101]所述浓缩麦芽酶重量百分比组成为:原麦芽酶80%，香味麦芽酶20%。
[0102]所述原麦芽酶制备方法如下:
[0103](I)高压脉冲电场(PEF)浸泡处理:将麦芽在预浸槽中用3倍20°C温水浸泡lOmin，使麦芽水分含量达到25%，同时进行高压脉冲电场(PEF)处理，电场强度20KV/cm，脉冲时间150 μ S，脉冲频率200Hz ；
[0104](2)粉碎:将步骤(1)中处理好的麦芽与浸泡水加入麦芽粉碎机带水粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到麦芽浆液；
[0105](3)超声、PEF提取:将麦芽浆液置于配料缸中，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度0.6A/25w条件下进行超声提取IOmin ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取15min,电场强度20KV/cm，脉冲时间400 μ S，脉冲频率200Hz ；
[0106](4)过滤:将提取液于室温用500目滤布预涂粒度为100目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14Mpa ·；
[0107](5)超滤浓缩:采用截留分子量90000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的10倍；
[0108](6)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量3%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150°C，排风温度75°C，干燥时间5s，产品水分4%，既得原麦芽酶。
[0109]所述香味麦芽酶制备方法如下:
[0110](I)麦芽回潮:用麦芽重量3%，温度为40_50°C温水均匀喷雾麦芽粒表面，置混合机中均匀混合3min。
[0111](2)烘焙:将回潮麦芽装入转筒式炒炉，在IOmin内温度升至170°C，保温lOmin，然后降温至100°C，保温20min，最后取出摊凉，得到香味麦芽；
[0112](3)粉碎:将香味麦芽加入麦芽粉碎机粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到香味麦芽粉；
[0113](4)超声、PEF提取:将香味麦芽粉置于配料缸中，加入3倍的水，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度0.6A/25W条件下进行超声提取IOmin ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取15min，电场强度20KV/cm，脉冲时间400 μ S，脉冲频率200Hz ；
[0114](5)过滤:将提取液于室温用500目滤布采用板框过滤机进行过滤，操作压力为
0.14Mpa ；
[0115](6)超滤浓缩:采用截留分子量90000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的10倍；
[0116](7)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量3%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150°C，排风温度75°C，干燥时间5s，产品水分4%，既得香味麦芽酶。
[0117]所述浓缩麦汁粉制备方法如下:
[0118](I)将麦芽粉碎，加入4倍的温水，用乳酸调节PH值为5.2，加入本发明的混合酶进行分段酶解，45°C蛋白休止90min,64°C糖化60min。
[0119](2)待糖化完全，将糖化醪液于74°C用500目滤布预涂粒度为100目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14Mpa，过滤得原麦汁；
[0120](3)将原麦汁采用截留分子量90000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液浓度为超滤前的10倍；
[0121](4)将浓缩液用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150°C，排风温度75°C，干燥时间5s，产品水分4%，既得浓缩麦汁粉。
[0122]所述混和酶是由如下质量份数的酶制剂均匀混合而成:
[0123]淀粉酶15份，蛋白酶15份，半纤维素酶15份，酯酶10份，。
[0124]所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0125]30%真菌α -淀粉酶，30%葡萄糖酶(糖化酶)，15% β -淀粉酶，15%普鲁兰酶，10%中温α -淀粉酶。
[0126]所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0127]30%木瓜蛋白酶， 20%中性蛋白酶，20%酸性蛋白酶，10%菠萝蛋白酶，10%脯氨酸蛋白酶，10%无花果蛋白酶。
[0128]所述中性蛋白酶的制备方法包括如下步骤:
[0129](I)菌种活化
[0130]将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，36°C培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
[0131]所述斜面培养基组成为:牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g, (NH)2S045g, K2HP048g, CaCl23g，琼脂 20g,中草药粉剂 IOg,蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0132]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0133]称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90°C保持4h，然后降温至60°C，加入混合物料总重量10%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:
1.5，控制温度至78°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0134]所述混合酶的重量份数组成为:内葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
[0135](2)液体种子扩大培养
[0136]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度36°C，培养时间15h ；
[0137]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0138]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度36°C，培养时间15h ；
[0139]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度36°C，搅拌速度400rpm，通风量(V/V) 1:2,罐压0.05Mpa,培养时间20h ；
[0140]所一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为:
[0141]酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，中草药粉齐?2%，海藻糖3%，硫酸钙lg，氯化镁2g，柠檬酸钠3g，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123°C灭菌40min。
[0142]所述种子罐培养基重量百分比组成为:[0143]麦芽糊精15%，酵母0.8%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123°C灭菌40mino
[0144]所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0xlO8个/ml ；
[0145](3)发酵罐发酵
[0146]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度36°C，搅拌速度700r/m，通风量(V/V)l:3，培养时间15h ;然后以2V /h降温速率缓慢降温至15°C，恒温培养20h ;继续以2V /h降温速率缓慢降温至5°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h ;最后以2°C /h升温速率缓慢升温至15°C，恒温培养20h ;继续以2V /h升温速率缓慢升温至36°C，恒温培养20h ；
[0147]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30% ；
[0148]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2 ；
[0149]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0150]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0151 ] 所述发酵培养基组成为:麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药粉剂50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，消泡剂Ig,纯净水1000mL, pH值7.2，121°C灭菌20min ；
[0152]所述补料培养基重量百分比组成为:麦芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草药剂粉10%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123°C灭菌40min。
[0153]所述发酵培养基的调配方法为:
[0154]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶(311/^玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温30min，然后缓慢升温至90°C保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.2，123°C灭菌40min备用。
[0155](4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量5%中草药粉剂。
[0156]所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0157]40%耐温葡聚糖复合酶，30% β-葡聚糖复合酶，10%甘露聚糖酶，10%的木聚糖酶，
[0158]10%的戊聚糖酶。
[0159]所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0160]50%酸性磷酸酶，30%脂肪酶，20%磷酸酯酶。
[0161]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:
[0162]氯化锌30份，氯化钙10份，硫酸钠10份，氯化镁5份。
[0163]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:
[0164]灵芝多糖20份，海藻多糖20份，NaCllO份，(NH4) S0410份，半胱氨酸10份。
[0165]制备方法:
[0166]将所述保护剂超微粉碎，确保粒度小于所述浓缩麦芽酶及混合酶，随后立即加入浓缩麦芽酶及混合酶，混合均匀，最后加入所述浓缩麦汁粉及激活剂，混合均匀后密封包装即得。
[0167]制得的复合酶麦芽香味浓郁，常温保存2年酶活损失率2.5%。
[0168]实施例2
[0169]一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶由以下重量份数的原料组成:
[0170]浓缩麦芽酶50 份，混和酶40份，浓缩麦汁粉15份，保护剂12份，激活剂12份。
[0171]所述浓缩麦芽酶重量百分比组成为:原麦芽酶82%，香味麦芽酶18%。
[0172]所述原麦芽酶制备方法如下:
[0173](I)高压脉冲电场(PEF)浸泡处理:将麦芽在预浸槽中用5倍35 °C温水浸泡15min，使麦芽水分含量达到30%，同时进行高压脉冲电场(PEF)处理，电场强度30KV/cm，脉冲时间180 μ S，脉冲频率250Hz ；
[0174](2)粉碎:将步骤(1)中处理好的麦芽与浸泡水加入麦芽粉碎机带水粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到麦芽浆液；
[0175](3)超声、PEF提取:将麦芽浆液置于配料缸中，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度1.5A/275W条件下进行超声提取12min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取18min,电场强度30KV/cm，脉冲时间500 μ S，脉冲频率250Hz ；
[0176](4)过滤:将提取液于室温用500目滤布预涂粒度为100目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.20Mpa ；
[0177](5)超滤浓缩:采用截留分子量85000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的12倍；
[0178](6)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量4%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间10s，产品水分3%，既得原麦芽酶。
[0179]所述香味麦芽酶制备方法如下:
[0180](I)麦芽回潮:用麦芽重量4%，温度为45°C温水均匀喷雾麦芽粒表面，置混合机中均匀混合4min。
[0181](2)烘焙:将回潮麦芽装入转筒式炒炉，在12min内温度升至180°C，保温12min，然后降温至105°C，保温25min，最后取出摊凉，得到香味麦芽；
[0182](3)粉碎:将香味麦芽加入麦芽粉碎机粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到香味麦芽粉；
[0183](4)超声、PEF提取:将香味麦芽粉置于配料缸中，加入5倍的水，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度1.5A/275W条件下进行超声提取12min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取18min，电场强度30KV/cm，脉冲时间500 μ S，脉冲频率250Hz ；
[0184](5)过滤:将提取液于室温用500-800目滤布采用板框过滤机进行过滤，操作压力为 0.14-0.24Mpa ；
[0185](6)超滤浓缩:采用截留分子量85000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的12倍；
[0186](7)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量4%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度80°C，干燥时间10s，产品水分3%，既得香味麦芽酶。
[0187]所述浓缩麦汁粉制备方法如下:
[0188](I)将麦芽粉碎，加入5倍的温水，用乳酸调节PH值为5.4，加入本发明的混合酶进行分段酶解，50°C蛋白休止90min，66V糖化60min。
[0189](2)待糖化完全，将糖化醪液于75°C用600目滤布预涂粒度为200目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.20Mpa，过滤得原麦汁；
[0190](3)将原麦汁采用截留分子量85000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液浓度为超滤前的12倍；
[0191](4)将浓缩液用酶制·剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度80°C，干燥时间10s，产品水分3%，既得浓缩麦汁粉。
[0192]所述混和酶是由如下质量份数的酶制剂均匀混合而成:
[0193]淀粉酶25份，蛋白酶25份，半纤维素酶25份，酯酶12份，
[0194]所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0195]30%真菌α -淀粉酶，30%葡萄糖酶(糖化酶)，15% β -淀粉酶，15%普鲁兰酶，
[0196]10%中温α -淀粉酶。
[0197]所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0198]30%木瓜蛋白酶，20%中性蛋白酶，20%酸性蛋白酶，10%菠萝蛋白酶，10%脯氨酸蛋白酶，10%无花果蛋白酶。
[0199]所述中性蛋白酶的制备方法包括如下步骤:
[0200](I)菌种活化
[0201]将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，30°C培养24h进行菌种活化，如此活化2次；
[0202]所述斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,琼脂 15g，中草药粉剂 5g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.0,121°C灭菌 20min ；
[0203]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0204]称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70°C保持2h，然后降温至45°C，加入混合物料总重量5%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1，控制温度至60°c保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0205]所述混合酶的重量份数组成为:内葡聚糖酶10份，外葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份。
[0206](2)液体种子扩大培养
[0207]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种I环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30°C，培养时间IOh ；
[0208]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0209]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间IOh ；
[0210]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V) 1:1，罐压0.05Mpa，
[0211]培养时间IOh; [0212]所一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为:
[0213]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，中草药粉剂
1.5%，海藻糖1%，硫酸钙Ig,氯化镁2g，柠檬酸钠lg，不足部分纯净水补足，pH值7.0,121 °C灭菌30min。
[0214]所述种子罐培养基重量百分比组成为:
[0215]麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草药粉剂1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%,柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121°C 灭菌 30min。
[0216]所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ；
[0217](3)发酵罐发酵
[0218]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度30°C，搅拌速度200r/m，通风量(V/V)l:l，培养时间IOh ;然后以1°C /h降温速率缓慢降温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h降温速率缓慢降温至2°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h ;最后以1°C /h升温速率缓慢升温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h升温速率缓慢升温至30°C，恒温培养15h ；
[0219]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15% ；
[0220]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.0 ；
[0221]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0222]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0223]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆饼粉15g，中草药粉剂30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，柠檬酸钠lg，消泡剂 0.1g,纯净水 1000mL, pH 值 7.0,121°C灭菌 20min ；
[0224]所述补料培养基重量百分比组成为:麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草药剂粉5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121°C灭菌30min。[0225]所述发酵培养基的调配方法为:
[0226]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温15min，然后缓慢升温至90°C保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0,121°C灭菌30min备用。
[0227](4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5%中草药粉剂。
[0228]所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0229]40%耐温葡聚糖复合酶，30% β-葡聚糖复合酶，10%甘露聚糖酶，10%的木聚糖酶，10%的戊聚糖酶。
[0230]所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0231 ] 50%酸性磷酸酶，30%脂肪酶，20%磷酸酯酶。
[0232]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:
[0233]氯化锌35份，氯化钙15份，硫酸钠15份，氯化镁8份。
[0234]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:
[0235]灵芝多糖25份，海藻多糖25份，NaCl 15份，(ΝΗ4) S0412份，半胱氨酸12份。
[0236]制备方法: [0237]将所述保护剂超微粉碎，确保粒度小于所述浓缩麦芽酶及混合酶，随后立即加入浓缩麦芽酶及混合酶，混合均匀，最后加入所述浓缩麦汁粉及激活剂，混合均匀后密封包装即得。
[0238]制得的复合酶麦芽香味浓郁，常温保存2年酶活损失率2.4%。
[0239]实施例3
[0240]一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶由以下重量份数的原料组成:
[0241 ] 浓缩麦芽酶60份，混和酶40份，浓缩麦汁粉20份，保护剂15份，激活剂15份。
[0242]所述浓缩麦芽酶重量百分比组成为:原麦芽酶85%，香味麦芽酶15%。
[0243]所述原麦芽酶制备方法如下:
[0244](I)高压脉冲电场(PEF)浸泡处理:将麦芽在预浸槽中用6倍50°C温水浸泡20min，使麦芽水分含量达到35%，同时进行高压脉冲电场(PEF)处理，电场强度40KV/cm，脉冲时间200 μ S，脉冲频率300Hz ；
[0245](2)粉碎:将步骤(1)中处理好的麦芽与浸泡水加入麦芽粉碎机带水粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到麦芽浆液；
[0246](3)超声、PEF提取:将麦芽浆液置于配料缸中，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度1.5A/275W条件下进行超声提取15min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取20min,电场强度40KV/cm，脉冲时间600 μ S，脉冲频率300Hz ；
[0247](4)过滤:将提取液于室温用800目滤布预涂粒度为300目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.24Mpa ；
[0248](5)超滤浓缩:采用截留分子量80000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的15倍；
[0249](6)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量5%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间15s，产品水分3%，既得原麦芽酶。
[0250]所述香味麦芽酶制备方法如下:
[0251](I)麦芽回潮:用麦芽重量4%，温度为50°C温水均匀喷雾麦芽粒表面，置混合机中均匀混合5min。
[0252](2)烘焙:将回潮麦芽装入转筒式炒炉，在15min内温度升至200°C，保温15min，然后降温至110°C，保温30min，最后取出摊凉，得到香味麦芽；
[0253](3)粉碎:将香味麦芽加入麦芽粉碎机粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到香味麦芽粉；
[0254](4)超声、PEF提取:将香味麦芽粉置于配料缸中，加入6倍的水，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度1.5A/275W条件下进行超声提取15min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取20min，电场强度40KV/cm，脉冲时间600 μ S，脉冲频率300Hz ；
[0255](5)过滤:将提取液于室温用800目滤布采用板框过滤机进行过滤，操作压力为
0.24Mpa ；
[0256](6)超滤浓缩:采用截留分子量80000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的15倍 ；
[0257](7)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量5%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间15s，产品水分3%，既得香味麦芽酶。
[0258]所述浓缩麦汁粉制备方法如下:
[0259](I)将麦芽粉碎，加入5倍的温水，用乳酸调节PH值为5.5，加入本发明的混合酶进行分段酶解，55 °C蛋白休止90min，66 V糖化60min。
[0260](2)待糖化完全，将糖化醪液于76°C用800目滤布预涂粒度为300目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.24Mpa，过滤得原麦汁；
[0261](3)将原麦汁采用截留分子量80000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液浓度为超滤前的15倍；
[0262](4)将浓缩液用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间15s，产品水分3%，既得浓缩麦汁粉。
[0263]所述混和酶是由如下质量份数的酶制剂均匀混合而成:
[0264]淀粉酶35份，蛋白酶30份，半纤维素酶30份，酯酶15份，。
[0265]所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0266]30%真菌α -淀粉酶，30%葡萄糖酶(糖化酶)，15% β -淀粉酶，15%普鲁兰酶，
[0267]10%中温α-淀粉酶。
[0268]所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0269]30%木瓜蛋白酶，20%中性蛋白酶，20%酸性蛋白酶，10%菠萝蛋白酶，10%脯氨酸蛋白酶，10%无花果蛋白酶。
[0270]所述中性蛋白酶的制备方法包括如下步骤:
[0271](I)菌种活化
[0272]将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，33°C培养30h进行菌种活化，如此活化2次；
[0273]所述斜面培养基组成为:牛肉膏6g，氯化钠8g，蛋白胨15g，葡萄糖4g，(NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，琼脂 18g，中草药粉剂 8g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C灭菌 20min ；
[0274]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0275]称取黄芪25份；党参16份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至50°C，加入混合物料总重量8%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.0,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:
1.2，控制温度至70°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0276]所述混合酶的重量份数组成为:内葡聚糖酶15份，外葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0277](2)液体种子扩大培养
[0278]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度33°C，培养时间12h ；
[0279]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0280]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度33°C，培养时间12h ；
[0281]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度33 °C，搅拌速度300rpm，通风量(V/V) 1:1.5，罐压0.05Mpa,培养时间15h ；
[0282]所一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为:
[0283]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.0%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，硫酸钙lg，氯化镁2g，柠檬酸钠2g，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121°C 灭菌 30min。
[0284]所述种子罐培养基重量百分比组成为:
[0285]麦芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米浆
0.3%，磷酸氢二钾1.0%，硫酸镁0.08%,柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121 °C 灭菌 30min。
[0286]所述种子罐发酵液菌体浓度为7.5xl08个/ml ；
[0287](3)发酵罐发酵
[0288]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度35°C，搅拌速度400r/m，通风量(V/V)l:2，培养时间12h ;然后以2V /h降温速率缓慢降温至12°C，恒温培养18h ;继续以2V /h降温速率缓慢降温至4°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h ;最后以2°C /h升温速率缓慢升温至12°C，恒温培养18h ;继续以2V /h升温速率缓慢升温至33°C，恒温培养18h ；
[0289]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20% ；[0290]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2 ；
[0291]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0292]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0293]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药粉剂40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂 0.5g,纯净水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0294]所述补料培养基重量百分比组成为:麦芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草药剂粉8%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121°C灭菌30min。
[0295]所述发酵培养基的调配方法为:
[0296]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶(311/^玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温20min，然后缓慢升温至90°C保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.2，121°C灭菌30min备用。
[0297](4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量3%中草药粉剂。
[0298]所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0299]40%耐温葡聚糖复合酶，30% β-葡聚糖复合酶，10%甘露聚糖酶，10%的木聚糖酶，10%的戊聚糖酶。
[0300]所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:
[0301 ] 50%酸性磷酸酶，30%脂肪酶，20%磷酸酯酶。
[0302]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:
[0303]氯化锌40份，氯化钙20份，硫酸钠20份，氯化镁10份。
[0304]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:
[0305]灵芝多糖30份，海藻多糖30份，NaCl20份，(NH4) SO415份，半胱氨酸15份。
[0306]本发明啤酒复合酶的制备方法:
[0307]将所述保护剂超微粉碎，确保粒度小于所述浓缩麦芽酶及混合酶，随后立即加入浓缩麦芽酶及混合酶，混合均匀，最后加入所述浓缩麦汁粉及激活剂，混合均匀后密封包装即得。·
[0308]制得的复合酶麦芽香味浓郁，常温保存2年酶活损失率2.2%。
[0309]试验实施例
[0310]1.使用方法:
[0311](I)原料重量百分比组成:甘肃景泰一级啤酒麦芽45%，大米20%，碎米35% ；
[0312](2)糖化阶段将本发明实施例3制得的啤酒复合酶制剂加入糖化锅:
[0313]首先准确称量啤酒复合酶，加入5倍的50°C糖化用水于不锈钢容器内，充分搅拌溶解5min，在糖化锅投料前IOmin加入糖化锅，然后开启糖化锅搅拌lOmin，进行正常糖化工艺。
[0314](3)添加量:添加量为麦芽干重的0.08%ο
[0315]作用条件:麦芽醪最适PH值5.2 ;蛋白休止温度50°C、时间90min ;最佳料水质量比1:5。混合糖化醪(麦芽醪与糊化醪混合)最适PH值5.4 ;糖化温度66°C;糖化时间60min。[0316]2.使用效果:
[0317]酿造10°淡爽型啤酒糖化阶段效果对照表
[0318]
【权利要求】
1.一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，由以下重量份数的原料组成: 浓缩麦芽酶40-60份，混和酶30-40份，浓缩麦汁粉10-20份，保护剂10-15份，激活剂10-15 份； 所述混和酶是由如下质量份数的酶制剂均匀混合而成:淀粉酶15-35份，蛋白酶15-30份，半纤维素酶15-30份，酯酶10-15份； 所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:30%木瓜蛋白酶，20%中性蛋白酶，20%酸性蛋白酶，10%菠萝蛋白酶，10%脯氨酸蛋白酶，10%无花果蛋白酶； 所述中性蛋白酶的制备方法包括如下步骤:枯草芽孢杆菌1398-2-12经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36°C，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后以1-2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2_5°C，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1-2°C /h升温速率缓慢升温至10_15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h升温速率缓慢升温至30_36°C，恒温培养15-20h ;发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体中性蛋白酶；所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药粉剂。
2.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，制备中性蛋白酶的斜面培养基组成为:牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，琼脂 15_20g，中草药粉剂 5-10g,蒸馏水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C灭菌 20min。
3.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，制备中性蛋白酶的种子培养基组成为:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷 酸氢二钾0.8-1.5%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1_3%，硫酸钙Ig,氯化镁2g,柠檬酸钠l_3g，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2。
4.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，制备中性蛋白酶的种子罐培养基组成为:麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2。
5.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，制备中性蛋白酶时种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml。
6.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，制备中性蛋白酶的发酵培养基组成为:麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g,海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，柠檬酸钠l_5g，消泡剂0.Ι-lg,纯净水1000mL, pH值7.0-7.2。
7.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:30%真菌α-淀粉酶，30%糖化酶，15% β -淀粉酶，15%普鲁兰酶，10%中温α -淀粉酶。
8.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:40%耐温β-葡聚糖复合酶，30%β-葡聚糖复合酶，10%甘露聚糖酶，10%的木聚糖酶，10%的戊聚糖酶。
9.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶，其特征在于，所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成:50%酸性磷酸酶，30%脂肪酶，20%磷酸酯酶。
10.一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶的制备方法，其特征在于，所述啤酒复合酶由以下重量份数的原料组成: 浓缩麦芽酶60份，混和酶40份，浓缩麦汁粉20份，保护剂15份，激活剂15份； 所述浓缩麦芽酶重量百分比组成为:原麦芽酶85%，香味麦芽酶15% ； 所述原麦芽酶制备方法如下: Cl)高压脉冲电场(PEF)浸泡处理:将麦芽在预浸槽中用6倍50°C温水浸泡20min，使麦芽水分含量达到35%，同时进行高压脉冲电场(PEF)处理，电场强度40KV/cm，脉冲时间`200 μ S，脉冲频率300Hz ； (2)粉碎:将步骤(1)中处理好的麦芽与浸泡水加入麦芽粉碎机带水粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到麦芽浆液； (3)超声、PEF提取:将麦芽浆液置于配料缸中，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度1.5A/275W条件下进行超声提取15min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取`20min,电场强度40KV/cm，脉冲时间600 μ S，脉冲频率300Hz ； (4)过滤:将提取液于室温用800目滤布预涂粒度为300目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.24Mpa ； (5)超滤浓缩:采用截留分子量80000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的15倍； (6)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量5%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间15s，产品水分3%，既得原麦芽酶； 所述香味麦芽酶制备方法如下: (1)麦芽回潮:用麦芽重量4%，温度为50°C温水均匀喷雾麦芽粒表面，置混合机中均匀混合5min ； (2)烘焙:将回潮麦芽装入转筒式炒炉，在15min内温度升至200°C，保温15min，然后降温至110°C，保温30min，最后取出摊凉，得到香味麦芽； (3)粉碎:将香味麦芽加入麦芽粉碎机粉碎，调整辊间距为0.5mm,转速为250rpm，得到香味麦牙粉； (4)超声、PEF提取:将香味麦芽粉置于配料缸中，加入6倍的水，边缓慢搅拌边用探头式超声提取仪在电流强度1.5A/275W条件下进行超声提取15min ;然后进行高压脉冲电场(PEF)提取20min，电场强度40KV/cm，脉冲时间600 μ S，脉冲频率300Hz ； (5)过滤:将提取液于室温用800目滤布采用板框过滤机进行过滤，操作压力为`0.24Mpa ； (6)超滤浓缩:采用截留分子量80000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液酶含量为超滤前的15倍； (7)干燥:向浓缩液中加入浓缩液重量5%的本发明保护剂，然后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间15s，产品水分3%，既得香味麦芽酶； 所述浓缩麦汁粉制备方法如下: (I)将麦芽粉碎，加入5倍的温水，用乳酸调节PH值为5.5，加入本发明的混合酶进行分段酶解，55 °C蛋白休止90min，66°C糖化60min ； (2)待糖化完全，将糖化醪液于76°C用800目滤布预涂粒度为300目硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.24Mpa，过滤得原麦汁； (3)将原麦汁采用截留分子量80000道尔顿的超滤膜循环浓缩，直至浓缩液浓度为超滤前的15倍； (4)将浓缩液用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度160°C，排风温度85°C，干燥时间15s，产品水分3%，既得浓缩麦汁粉； 所述混和酶是由如下质量份数的酶制剂均匀混合而成: 淀粉酶35份，蛋白酶30份，半纤维素酶30份，酯酶15份， 所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成: 30%真菌α -淀粉酶，30%葡萄糖酶，15% β -淀粉酶，15%普鲁兰酶， 10%中温α -淀粉酶； 所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成: 30%木瓜蛋白酶，20%中性蛋白酶，20%酸性蛋白酶，10%菠萝蛋白酶，10%脯氨酸蛋白酶，10%无花果蛋白酶； 所述中性蛋白酶的制备`方法包括如下步骤: (1)菌种活化 将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，33°C培养30h进行菌种活化，如此活化2次； 所述斜面培养基组成为:牛肉膏6g,氯化钠8g,蛋白胨15g,葡萄糖4g, (NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，琼脂 18g，中草药粉剂 8g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C灭菌 20min ；所述中草药粉剂的制备方法如下: 称取黄芪25份；党参16份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至50°C，加入混合物料总重量8%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.0，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1.2，控制温度至70°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂； 所述混合酶的重量份数组成为:内β -葡聚糖酶15份，外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份； (2)液体种子扩大培养 ①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度33°C，培养时间12h ； ②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同； ③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度33°C，培养时间12h ； ④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度33°C，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)l:l.5，罐压0.05Mpa，培养时间15h ； 所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为: 酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.0%，中草药粉剂`1.8%，海藻糖2%，硫酸钙lg，氯化镁2g，柠檬酸钠2g，不足部分纯净水补足，pH值7.2 ; 所述种子罐培养基重量组成为: 麦芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米浆0.3%，磷酸氢二钾1.0%，硫酸镁0.08%,柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.2 ; 所述种子罐发酵液菌体浓度为7.5xl08个/ml ； (3)发酵罐发酵 将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度35°C，搅拌速度400r/m，通风量(V/V)l:2，培养时间12h ;然后以2V /h降温速率缓慢降温至12°C，恒温培养18h ;继续以2°C /h降温速率缓慢降温至4°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h ;最后以2°C /h升温速率缓慢升温至12°C，恒温培养18h ;继续以2 V /h升温速率缓慢升温至33 °C，恒温培养18h ； 溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20% ； PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2 ； 补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2-5mg/ml ； 放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢； 所述发酵培养基组成为:麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药粉剂40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂 0.5g,纯净水 1000mL, pH 值 7.2 ; 所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草药剂粉8%，不足部分纯净水补足，pH值7.2 ; 所述发酵培养基的调配方法为: 按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值`7.2，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温20min，然后缓慢升温至90°C保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.2，121°C灭菌30min备用； (4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量3%中草药粉剂； 所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成: 40%耐温β -葡聚糖复合酶，30% β -葡聚糖复合酶，10%甘露聚糖酶，10%的木聚糖酶，10%的戊聚糖酶； 所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成: 50%酸性磷酸酶，30%脂肪酶，20%磷酸酯酶； 所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成: 氯化锌40份，氯化钙20份，硫酸钠20份，氯化镁10份； 所述保护剂由以下重量份数的原料组成: 灵芝多糖30份，海藻多糖30份，NaCl 20份，(ΝΗ4) S04 15份，半胱氨酸15份；制备方法:将所述保护剂超微粉碎，确保粒度小于所述浓缩麦芽酶及混合酶，随后立即加入浓缩麦芽酶及混合酶，混合均匀，最后加 入所述浓缩麦汁粉及激活剂，混合均匀后密封包装即得。
【文档编号】C12N9/24GK103865701SQ201310683679
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李洪兵, 张锦杰, 李海清, 朱永明, 胡永明, 向左东 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司