一种利用提油后藻渣生产生物乙醇的方法
【专利摘要】一种利用提油后藻渣生产生物乙醇的方法，将藻渣制成藻浆，加入纤维素酶，混合均匀，调节pH6.0，置于45~60℃水浴中3~6小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液；水与藻渣酶解液之比为9~3:1，并加入硝酸钠或氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钠；121℃，20分钟灭菌后，接入酵母菌发酵，温度30~40℃、初始pH5.0~7.0、100~500转/分钟搅拌，发酵48~72小时；以变速流加方式流加灭菌后的酶解液，收集乙醇气体。本发明发酵过程操作简单，生产成本低，乙醇产率高，无环境污染，可规模化，实现废弃物资源化，是一种满足工业化需求、实用性很强的新方法。
【专利说明】—种利用提油后藻渣生产生物乙醇的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]众所周知，能源、环境和粮食问题系人类社会面临和必须解决的三大难题。微藻生物能源是目前国际上公认缓解上述危机的理想途径之一，发展潜力巨大。微藻种类繁多、分布广，是一群最简单、最古老的低等植物，微藻能够利用阳光、CO2及废水中的N、P等营养物快速生长并可在胞内合成大量油脂等代谢物。利用微藻细胞可制备出生物柴油等多种形式的生物能源产品，目前微藻生物能源已经成为国内外研究热点领域之一。针对微藻生物能源，美国于2007年启动了“微型曼哈顿计划”，其宗旨是向海洋藻类要能源，以帮助美国摆脱严重依赖进口石油的窘境；2008年，英国碳基金公司启动了利用藻类开发航空燃料项目，投入2600万英镑用于发展相关技术和基础设施，该项目预计到2020年实现商业化；我国科技部于2011年启动了首个微藻能源“973计划”项目，旨在强化我国在微藻生物能源方面的基础研究。通过世界各国共同的努力，微藻生物能源研究已经取得了巨大的进展，但距离产业化尚有一段路程要走。这主要是由于当前微藻油脂产率低、后加工能耗高、提油后藻渣未被利用等造成生产成本过高。
[0003]微藻细胞除含油脂外，还含大量的碳水化合物，蛋白质等，因此在微藻制备高品质生物柴油过程中会产生大量的残余物质，即提油后藻渣，以上物质若不加以利用将造成藻体残渣高价值多元组成的浪费和环境污染。实际上，藻体残渣是重要的生物质资源。经相关转化技术，将提油后藻渣转化 成糖类物质和蛋白质，通过产乙醇酵母发酵，可获得纯净的生物乙醇。目前微藻生产生物柴油尚未实现工业化生产，目前采用的生产方式微藻产油效率比较低，还没有发现一种可将提油后藻渣充分利用的方法。本专利即为一种利用提油后藻渣酶解液发酵产乙醇的方法，充分利用微藻生物质资源，提高微藻生物柴油生产系统整体经济性，该工艺路线尚未有文献报道。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中提油后藻渣未被充分利用，木质纤维素类生物质(水稻秸杆等)转化生物乙醇预处理成本高、副产物多等问题，本发明的目的在于提供一种利用提油后藻渣酶解后发酵生产生物乙醇的方法，该方法高效、藻渣酶解效率高、发酵生产生物乙醇生产成本低、酶解液利用效率高、藻渣较木质纤维素类生物质更容易酶解、反应条件温和、环境友好、操作过程简单。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案实现的。
[0006]一种利用提油后藻渣生产生物乙醇的方法，其特征在于藻渣经酶解，灭菌后发酵产乙醇，发酵过程流加酶解液。具体步骤为。
[0007](I)藻渣加入水，制成藻浆，按藻渣干物质5-50mg/g的量加入纤维素酶，混合均匀，调节pH6.0，置于45飞(TC水浴中3飞小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液。
[0008](2)水与藻渣酶解液之比为9~3:1，并加入10(Tl000mg/L硝酸钠或氯化铵、20(Tl000mg/L硫酸镁和20(T500mg/L磷酸二氢钠；121°C，20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度3(T40°C、初始pH 5.0-7.0、搅拌转速100~500转/分钟，发酵时间48~72小时。发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为f 5mL/L/h，最后6小时流加速度为f 5mL/L/h，中间阶段流加速度为l(T20mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体。
[0009]利用高效液相色谱仪检测藻渣酶解液中糖含量，用凯氏定氮仪测定藻渣酶解液中蛋白质含量，用气相色谱仪检测生物乙醇产量。
[0010]本发明所述酵母菌为酿酒酵母cereFisiae),可从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得，其保藏编号为CICC 1747。
[0011]本发明所述的纤维素酶为购自酶制剂公司丹尼斯克子公司杰能科国际有限公司的市售商品酶 Accellerase 1000 或 Excel 纤维素酶或 Accellerase 1500 或 AccelleraseTRIO或Accellerase DUET或购自诺维信公司的市售商品酶Celluclast 1.5L或Novozyme188 或 Novozyme 476 或 Novozyme988 或 Cellic CTec2。
[0012]本发明生物乙醇的生产是利用提油后藻渣，酵母发酵产乙醇过程变速流加藻渣酶解液，利用易于酶解的生物质藻渣产乙醇，提高乙醇产率，发酵过程操作简单，生产成本低，无环境污染，可规模化，实现废弃物资源化 ，是一种满足工业化需求、实用性很强的新方法。
【具体实施方式】
[0013]本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0014]以下实施例所用到的小球藻，可从中国典型微生物保藏中心(武汉)获得，其保藏编号为CCTCC M209256 ;所用到的微拟球藻、原核小球藻和雨生红球藻，可从美国德州大学UTEX藻种库获得，其保藏编号分别为LB2164、256和2505;所用到的莱茵衣藻，可从中国科学院水生生物研究所淡水藻种库获得，其保藏编号为FACHB-265。
[0015]实施例1。
[0016]将小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基(mg/L):NaCl 24000, Na2EDTA 10，FeSO4.7Η20 50,NaH2PO4 20,MgCl2 20和NaNO3 100置于光照培养箱中静置培养，培养温度250C，光照强度2000Lux，培养10天。培养到第10天的500g小球藻经离心(8000转/分钟，10分钟)获得湿藻体，蒸馏水冲洗5次，经高压灭菌锅预处理(121°C，20分钟)后，用正己烷和乙醇来提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1:1:2，水相经离心(12000转/分钟，15分钟)后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自来水或蒸馏水，制成藻衆，加入纤维素酶(20mg/g藻渣干物质)，混合均匀，调节pH6.0，置于55°C水浴中4小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液；检测其中糖含量和蛋白质含量。
[0017]水与藻渣酶解液之比为9:1，并加入200mg/L硝酸钠、200mg/L硫酸镁和500mg/L磷酸二氢钠，121°C,20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度37°C、初始pH
5.5、搅拌转速200转/分钟，发酵时间72小时。发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为3mL/L/h，最后6小时流加速度为3mL/L/h，中间阶段流加速度为15mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体。结果见表1。
[0018]实施例2。
[0019]将微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基(mg/L):NaCl 30000, Na2EDTA 20，FeSO4.7Η20 30,NaH2PO4 30,MgCl2 20和NaNO3 200置于光照培养箱中静置培养，培养温度250C，光照强度2000Lux，培养10天。培养到第10天的500g微拟球藻经离心(8000转/分钟，10分钟)获得湿藻体，蒸馏水冲洗3次，经高压灭菌锅预处理(121°C，20分钟)后，用正己烷和乙醇来提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1:1:2，水相经离心(15000转/分钟，10分钟)后，用蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自来水或蒸馏水，制成藻浆，加入纤维素酶(40mg/g藻渣干物质)，混合均匀，调节pH6.0,置于60°C水浴中3小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液；检测其中糖含量和蛋白质含量。
[0020]水与藻渣酶解液之比为7:1，并加入300mg/L硝酸钠、300mg/L硫酸镁和400mg/L磷酸二氢钠，115°C，20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度35°C、初始pH6.0、搅拌转速200转/分钟,发酵时间60小时。发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为5mL/L/h，最后6小时流加速度为5mL/L/h，中间阶段流加速度为15mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体。结果见表1。
[0021]实施例3。
[0022]将原核小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基(mg/L):蛋白胨1000, NaCl 25,CaCl2.2H20 25，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75 和 NaNO3 250 置于光照培养箱中静置培养，培养温度25°C，光照强度2000LUX，培养10天。培养到第10天的500g原核小球藻经离心(8000转/分钟，10分钟)获得湿藻体，蒸馏水冲洗5次，经高压灭菌锅预处理(115°C，20分钟)后，用正己烷和乙醇来提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为I:1:2，水相经离心(12000转/分钟，20分钟)后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自来水或蒸馏水，制成藻浆，加入纤维素酶(20mg/g藻渣干物质)，混合均匀，调节pH6.0，置于50°C水浴中5小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液；检测其中糖含量和蛋白质含量。
[0023]水与藻渣酶解液之比为4:1，并加入400mg/L硝酸钠、300mg/L硫酸镁和300mg/L磷酸二氢钠，121°C，20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度40°C、初始pH6.5、搅拌转速300转/分钟,发酵时间60小时。发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为lmL/L/h，最后6小时流加速度为lmL/L/h，中间阶段流加速度为20mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体。结果见表1。
[0024]实施例4。
[0025]将雨生红球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基(mg/L):NaCl 25, Na2EDTA 50,FeSO4.7H20 4.98，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75，ZnSO4.7H20 8.82，CaCl2.2H2025，CuSO4.5Η20 1.57，MnCl2 1.44，MoO3 0.71, H3BO3 11.42，KOH 31 和 NaNO3 250 置于光照培养箱中静置培养，培养温度25°C，光照强度2000LUX，培养10天。培养到第10天的500g雨生红球藻经离心(8000转/分钟，10分钟)获得湿藻体，蒸馏水冲洗5次，经高压灭菌锅预处理(115°C，20分钟)后，用正己烷和乙醇来提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1:1:2，水相经离心(12000转/分钟，20分钟)后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自来水或蒸馏水，制成藻浆，加入纤维素酶(20mg/g藻渣干物质)，混合均匀，调节PH6.0,置于50°C水浴中5小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液；检测其中糖含量和蛋白质含量。
[0026]水与藻渣酶解液之比为4:1，并加入400mg/L硝酸钠、硫酸镁300mg/L和300mg/L磷酸二氢钠，121°C，20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度40°C、初始pH
.6.5、搅拌转速300转/分钟,发酵时间60小时。发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为lmL/L/h，最后6小时流加速度为lmL/L/h，中间阶段流加速度为20mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体用于检测。结果见表1。
[0027]实施例5。
[0028]将莱茵衣藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基(mg/L):NaCl 25，Na2EDTA 0.05，FeCl3.6Η20 0.5, K2HPO4 75, KH2PO4 175，MgSO4.7Η20 75 和 NaNO3 250 置于光照培养箱中静置培养，培养温度25°C，光照强度2000Lux，培养10天。培养到第10天的500g莱茵衣藻经离心(8000转/分钟，10分钟)获得湿藻体，蒸馏水冲洗5次，经高压灭菌锅预处理(115°C，20分钟)后，用正己烷和乙醇来提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1:1:2,水相经离心(12000转/分钟，20分钟)后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自来水或蒸馏水，制成藻浆，加入纤维素酶(20mg/g藻渣干物质)，混合均匀，调节PH6.0，置于50°C水浴中5小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液；检测其中糖含量和蛋白质含量。
[0029]水与藻渣酶解液之比为4:1，并加入400mg/L硝酸钠、300mg/L硫酸镁和300mg/L磷酸二氢钠，121°C，20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度40°C、初始pH
.6.5、搅拌转速300转/分钟,发酵时间60小时。发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为lmL/L/h，最后6小时流加速度为lmL/L/h，中间阶段流加速度为20mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体用于检测。结果见表1。
[0030]对比例I。
[0031]将酿酒酵母经无菌操作接种于灭菌发酵液(mg/L):葡萄糖60 000，蛋白胨5000，酵母粉2 000，麦芽汁2 000，置于发酵罐中发酵，发酵温度37°C，初始pH 5.5、搅拌转速150转/分钟，发酵72小时。分析乙醇产量，结果见表1。
[0032]对比例2。
[0033]将酿酒酵母经无菌操作接种于灭菌发酵液(mg/L):葡萄糖50 000，蛋白胨5000，酵母粉2 000，麦芽汁2 000，置于发酵罐中发酵，发酵温度37°C，初始pH 5.5、搅拌转速300转/分钟，发酵60小时。分析乙醇产量，结果见表1。
[0034]表1实施例及对比结果
【权利要求】
1.一种利用提油后藻渣生产生物乙醇的方法，其特征是按以下步骤: (1)在藻渣加入水，制成藻浆，按藻渣干物质5-50mg/g的量加入纤维素酶，混合均匀，调节pH6.0,置于45飞(TC水浴中3飞小时，酶解过程加搅拌，反应结束后经离心得到上清液即为藻渣酶解液； (2)水与藻渣酶解液之比为9~3:1，并加入10(Tl000mg/L硝酸钠或氯化铵、20(Tl000mg/L硫酸镁和20(T500mg/L磷酸二氢钠；121°C，20分钟灭菌后，接入酵母菌进行发酵，发酵过程中温度3(T40°C、初始pH 5.0-7.0、搅拌转速100~500转/分钟，发酵时间48~72小时；发酵过程中补料以流加方式进行，流加灭菌后的酶解液，流加采用变速流加，起始6小时流加速度为f5mL/L/h，最后6小时流加速度为f 5mL/L/h，中间阶段流加速度为l(T20mL/L/h，流加速度通过设置发酵罐相关参数来控制；收集乙醇气体。
【文档编号】C12P7/10GK103710394SQ201310685311
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】刘玉环, 郑洪立, 阮榕生, 高振, 万益琴, 黄和, 巫小丹, 王允圃 申请人:南昌大学