一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用，该质粒的序列如SEQ?ID?NO.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。该质粒和rep表达质粒共高压注射哺乳动物体内可用于外源基因定点整合于人类19号染色体上的AAVS1特定位点以表达人类凝血因子IX。使用该表达质粒可以稳定表达人类凝血因子IX，且加大了整合系统在肝中的整合效率，从而实现更高的表达量和更长的表达时间。
【专利说明】—种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用。
【背景技术】
[0002]在自然界的许多天然的转基因事件中，有一些事件在长期进化过程中被证明是安全的。其中，人类基因组最具有意义的是其19号染色体上有一个被称之为AAV病毒的整合位点 AAVSl (adeno-associated virus integration sitel)。自然情况下，AAV 仅仅整合在AAVSl ;在体外实验条件下,也有超过75%的AAVITR (inverted terminal repeat)附加的基因可以在rep蛋白指导下整合在AAVSl。 [0003]迄今为止，国内外的一系列研究成果都未发现任何已知人类疾病与AAV感染相关。此结论的重要性在于:该结论是以成年人大于90%的AAV感染率为前提得出的，具有高度可靠性，而AAV结构中的关键成分R印蛋白和介导整合的顺式元件——位于AAV ITR或位于P5启动子内的核心元件16bp RBE (rep binding element),已经多次体内、外实验证实，可以构成可靠的定点整合转基因系统(Hum Gene Ther.2010; 21 (6): 728-38.GeneTher.2009;16(5):589-95.J Mol Biol.2006;358(I):38-45.)。
[0004]然而，单纯的含有此16bp RBE的定点整合转基因系统还存在着体外介导整合的效率尚可，体内介导整合的效率不闻、基因表达广物的量有待进一步提闻的缺点(GeneTher.2009; 16 (5): 589-95.)。而 hAAT 启动子和 HCR (hepatic locus control region)兀件可以增加以上定点整合转基因系统的体内表达效率(Mol Ther.2001; 3 (6):948-57.MolTher2000;l(6):522-32.J Surg Res.1994; 56 (6):510-17.)。因此，将定点整合系统所需核心元件和肝特异性调控元件(hAAT启动子、HCR元件)结合起来构建一个新的转基因表达系统，则可以在提供定点整合、保证安全的如提下提闻转基因的表达效率。
【发明内容】
[0005]本发明描述了一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的构建和应用。
[0006]本发明所述的pRBE-HCR-hAAT-hFIXml，序列如SEQ ID N0.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。
[0007]所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的构建方法，是将hAAT启动子和HCR调控元件插入去除了 CMV启动子的pRBE-CMV-FIXml的位点Nhe I和Bgl II之间得到pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
[0008]构建方法具体包括以下步骤:
[0009]I) pRBE-CMV-FIXml 去 CMV 启动子载体获得
[0010]以pRBE-CMV-FIXml为模板，引物两端分别加入了酶切位点Bgl I1.Nhe I，以这两引物扩增不含CMV启动子的质粒骨架；PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化；
[0011]2) hAAT片段扩增及pT-hAAT的构建[0012]以人基因组DNA为模板，用含Nhe I的上游引物和含Bgl II的下游引物扩增获得Nhe 1-hAAT-Bgl II DNA片段，将此片段用Nhe I和Bgl II酶切后连接于T载体，得到pT-hAAT ；
[0013]3) HCR片段扩增
[0014]以人基因组DNA为模板，用含Spe I的上游引物和含Spe I的下游引物扩增获得Spe 1-HCR-Spe I DNA 片段；
[0015]4) pT-HCR-hAAT 构建
[0016]用Nhe I酶切T-hAAT，用DNA凝胶回收试剂盒纯化，与用Spe I酶切回收的HCR片段连接后，获得pT-HCR-hAAT ；
[0017]5) HCR-hAAT 片段的 PCR 扩增
[0018]以pT-HCR-hAAT为模板，用含Nhe I的上游引物和含Bgl II的下游引物扩增获得Nhe 1-HCR-hAAT-Bgl II DNA 片段；
[0019]6) pRBE-HCR-hAAT-hFIXml 构建
[0020]“Nhe 1-HCR-hAAT-Bgl II ” 双链 DNA 片段进行 Nhe I 和 Bgl II 双酶切，通过DNA重组技术插入经Nhe I和Bgl II双酶切的pRBE-CMV-FIXml重组质粒，获得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
[0021]本发明还公开了 pRBE-HCR-hAAT-hFIXml用于将外源基因hFIXml定点整合于人染色体的AAVSl特定位点，使哺乳动物体内稳定表达hFIX的用途。
[0022]本发明的优点在于在筛选基因表达序列和启动子之间设计插入肝特异性控制元件和RBE整合元件。该质粒和rep表达质粒共高压注射哺乳动物体内可用于外源基因定点整合于人类19号染色体上的AAVSl特定位点以表达人类凝血因子IX。特点为:携带的RBE顺式元件可以介导r印蛋白依赖的AAVSl位点整合；hAAT肝特异性启动子和HCR肝特异性控制元件可以提高质粒在肝中的表达量并延长其表达时间，最后定点整合于染色体上AAVSl位点。使用该表达质粒可以稳定表达人类凝血因子IX，且加大了整合系统在肝中的整合效率，从而实现更高的表达量和更长的表达时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:pRBE-HCR-hAAT-hFIXml 示意图。全长:7620bp ;主要元件:hAAT 启动子(1-344)，HCR 调控元件(345-771)，RBEitr 整合元件(785-801)，hFIXml 基因(811-3610)。
【具体实施方式】
[0024]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。本发明所述的制备工艺，采用常规分子生物学方法，所有中间产物和最后产品均已经DNA测序认定。
[0025]实施例1:pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体获得及纯化
[0026]根据pRBE-CMV-FIX 序列(Gene Ther.2009 ; 16 (5): 589-95.J MolBiol.2006; 358 (I):38-45.)设计特异性引物(见表1_引物)，同时，在Y和3'端分别加入酶切位点Bgl II和Nhe I。以pRBE-CMV-FIX为模板，扩增出目的条带。
[0027]表1-引物
【权利要求】
1.一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒，其特征在于，该质粒的序列如SEQ ID N0.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。
2.一种制备权利要求1所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒的方法，其特征在于，hAAT启动子和HCR调控元件插入去除了 CMV启动子的pRBE-CMV-FIXml质粒的位点Nhe I和BglII之间得到 pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步骤: DpRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体获得 以质粒pRBE-CMV-FIXml为模板，引物两端分别加入了酶切位点Bgl I1.Nhe I，以这两引物扩增不含CMV启动子的质粒骨架；PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化； 2)hAAT片段扩增及pT-hAAT的构建 以人基因组DNA为模板，用含Nhe I的上游引物和含Bgl II的下游引物扩增获得Nhe 1-hAAT-Bgl II DNA片段，将此片段用Nhe I和Bgl II酶切后连接于T载体，得到质粒pT-hAAT ； 3)HCR片段扩增 以人基因组DNA为模板，用含Spe I的上游引物和含Spe I的下游引物扩增获得Spe1-HCR-Spe I DNA 片段； 4)pT-HCR-hAAT 质粒构建` 用Nhe I酶切pT-hAAT，用DNA凝胶回收试剂盒纯化，与用Spe I酶切回收的HCR片段连接后，获得PT-HCR-hAAT ； 5)HCR-hAAT片段的PCR扩增 以pT-HCR-hAAT为模板，用含Nhe I的上游引物和含Bgl II的下游引物扩增获得Nhe1-HCR-hAAT-Bgl II DNA 片段；
6)pRBE-HCR-hAAT-hFIXml 构建 “Nhe 1-HCR-hAAT-Bgl II ” 双链 DNA 片段进行 Nhe I 和 Bgl II 双酶切，通过DNA重组技术插入经Nhe I和Bgl II双酶切的pRBE-CMV-FIXml重组质粒，获得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
4.权利要求1所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml用于将外源基因hFIXml定点整合于人染色体的AAVSl特定位点，使哺乳动物体内稳定表达hFIX的用途。
【文档编号】C12N15/66GK103667346SQ201310693612
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】许正新, 陈金中, 叶娟, 张阿敏, 谢林俊 申请人:扬州大学