过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法及其应用，所述过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法包括步骤：A）hASCs的获取、纯化及扩增；B）携带MT基因的腺相关病毒载体的构建；C）重组腺相关病毒载体感染hASCs，得到MT-hASCs。本发明将干细胞技术与先进的基因载体治疗手段相结合，探索提高各项机能的新方法，为传统临床医学技术带来了革命性变化，具有重要的作用和深远的意义。
【专利说明】过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种可以过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法及其应用
【背景技术】
[0002]衰老是人类生命过程的必然规律，但自古以来，长命百岁、青春永驻就是人们梦寐以求的美好愿望，也是当今人类共同关心的问题。抗衰老研究也成为21世纪生理科学中的热点课题。随着人体的衰老，各项机能的退化是不可避免的，如何全面有效提高人体机能进而延缓衰老进程，是目前研究的热点。
[0003]干细胞在抗衰老领域的应用正开展得如火如荼。科学家证实于细胞内含有几十种人体细胞代谢促分化酶，提高人体的抗氧化能力，维持活细胞数量和死亡的平衡，继而实现细胞的养生，从而延缓脏器的衰老，也可能通过改善血供等途径而改善宿主的间质结构，从而为受体的支架细胞服务，延缓机体的衰老过程。
[0004]间充质干细胞(mesenchymal stemcel Is, MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，是目前免疫治疗及抗衰老研究的热点。
[0005]金属硫蛋白(metallothionein, MT)是富含半胱氨酸的短肽,对多种重金属有高度亲和性。它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。有许多研究表明，MT在清除自由基与抗氧化的同时，通过对机体超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)及谷胧甘肤过氧化物酶(GSH —` Px)等活性的提高，可明显增强机体的抗衰老能力(MeydaniM,1998)。
[0006]由于MT具有十分重要的生理学功能，因此如何开发利用MT已成为当前研究的热点课题。目前国内开展了多项关于MT的研究，在癌症治疗、细胞抗药性等方面取得了显著的成果。现有技术中有将MT运用腺病毒转基因技术过表达在人脐带间充质干细胞上，进行除铅治疗，并有一定的疗效。但该技术没有解决其取材的便利性、细胞含量及扩增能力等方面存在的缺陷。
[0007]所以我们亟需一种方法，使其既能克服以上所述的劣势，又能对人体多方面进行综合性改善，提高整体机能，进而有效延缓衰老。
【发明内容】
[0008]本发明采用腺相关病毒转基因技术使脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedstemcells, hASCs)过表达 MT,再将 MT-hADSCs 细胞输入动物模型体内，从而达到综合性的延缓衰老效果。腺相关病毒不会整合到宿主细胞基因组，方法安全可靠。
[0009]采用的技术方案为:
[0010]过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法，包括步骤:
[0011]A) hASCs的获取、 纯化及扩增；
[0012]B)携带MT基因的腺相关病毒载体的构建；
[0013]C)重组腺相关病毒载体感染hASCs，得到MT-hASCs。
[0014]本发明采用腺相关病毒的高效感染可以提高hASCs细胞中MT的表达效率。hASCs细胞来源广泛、细胞含量高、取材容易、移植的免疫排斥反应很低，并且无伦理道德等问题，避免了直接注射腺相关病毒入体内，降低移植治疗的副作用和风险。因此，本发明的技术是先进的、安全可靠的。
[0015]本发明将干细胞技术与先进的基因载体治疗手段相结合，探索提高各项机能的新方法，为传统临床医学技术带来了革命性变化，具有重要的作用和深远的意义。
[0016]本发明利用hASCs具有的免疫原性低；具有多向分化能力；增殖能力强，生物学特性稳定；具有免疫调节功能，异体移植不引起免疫排斥反应；无伦理、道德及法律方面的限制；相对纯净，污染机会少等优势。
[0017]本发明利用腺相关病毒转基因快速、方便、安全的优点，将MT转入hASCs中过表达，将两种最新的治疗科技完美结合，进而输入人体，对多项机能有促进作用。
[0018]本发明开展MT-hASCs促多项机能临床试验，建立临床有效性安全性评价体系，获得MT-hASCs促机能方案和技术标准。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1所示为为实施例中hASCs培养状态(图1A为40X，图1B为100X)
[0020]图2所示为为实施例中hASCs成脂分化(图2A为200X，图2B为400X)
[0021]图3所示为为实施例中hASCs成骨分化(图3A为400X，图3B为400X)
[0022]图4所示为为实施例中RT-PCR技术鉴定MT mRNA的表达情况
[0023]图5所示为实施例中各组小鼠平均总进食量示意图
[0024]图6所示为实施例中各组小鼠平均体重的变化示意图
具体实施例
[0025]下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
[0026]实施例1hASCs的获取、纯化及扩增
[0027]( I) hASCs的分离和原代培养
[0028]脂肪标本来自美容整形门诊接受抽脂术的健康供者。取20ml抽脂术获得的脂肪组织，用胶原酶消化法分离hASCs，并通过贴壁培养的方法对其进一步纯化。
[0029]hASCs流式检测指标和表达的指标标准为:
[0030]CD105 不得低于 85%
[0031]CD73 不得低于 70%
[0032]CD9O不得低于％%[0033]CD45 不得过 2%
[0034]CD79a 或 CD19 不得过 2%
[0035]HLA-DR 不得过 2%
[0036]CD34 不得过 2%
[0037]CD14 不得过 2%
[0038]制备得到的细胞完全符合上述8个指标的标准，并且在第二代的时候就达到了很高的纯度(95%以上)和很好的稳定性。成体细胞传代次数越低，越有利于保证细胞的生物学活性和遗传稳定性。
[0039](2 ) hASCs的传代培养与扩增
[0040]观察原代培养细胞贴壁生长至80%以上融合时，胰蛋白酶消化细胞，按1:3比例传代培养，计为第I代(passagel，Pl)hASCs0待细胞生长至80%以上融合时，重复上述操作进行P2、P3代细胞培养扩增。
[0041](3) hASCs的诱导分化
[0042]取达到80%以上融合的hASCs，胰蛋白酶消化，完全培养基重悬后接种于24孔板，细胞达到60%融和时，分别换用成骨诱导培养基及成脂诱导培养基诱导分化，设置对照组。诱导分化21天后，固定细胞， 显微镜下观察、记录结果。
[0043]实验获取了较好活性的hASCs。图1显示hASCs培养状态。分离出的MSC具有很强的干性，能被诱导分化成脂、成骨细胞等(图2、3)。
[0044]实施例2构建携带MT基因的腺相关病毒体系
[0045]通过DNA重组技术将MT序列导入腺相关病毒载体，采用磷酸钙共沉淀法，将重组腺相关病毒载体rAAV-hMT、包装质粒、辅助质粒共转染到宿主细胞中，完成腺相关病毒包装和扩增。确定腺相关病毒感染的合适滴度、多次感染的间隔时间、感染持续时间和感染次数。最终，完成腺相关病毒的鉴定和基因测序。
[0046]AV (腺病毒)和AAV (腺相关病毒)都可以作为基因治疗的载体，目前有技术应用AV整合MT进行除铅。AV载体较易制备和操作，理化性质稳定，遗传毒性较低，但不能整合到靶细胞基因组DNA中，且可能诱发机体的免疫反应，故其介导的转基因表达时间短。AAV载体既可以转染分裂细胞，也可以转染非分裂细胞，在宿主体内以定向整合的方式存在，对人体无致病性，故AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达，还可避免随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险。
[0047]实施例3重组腺相关病毒rAAV-hMT感染hASCs，得到MT-hASCs
[0048]采用RT-PCR技术，鉴定MSC中MT mRNA的表达情况。待细胞长至80%密度，用PBS洗3遍后，加Iml TRIzol试剂提取细胞总RNA。核酸检测仪检测RNA质量和浓度，取2 μ g的总RNA，利用逆转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA。荧光实时定量PCR鉴定hMT mRNA水平。同时设置6个浓度梯度，制作标准曲线。根据标准曲线，计算细胞株1、细胞株2和细胞株3中hMT mRNA和内参基因β -actin mRNA的相对含量。重复检测3次。
[0049]结果显示细胞株3中hMT mRNA表达水平较细胞株1、细胞株2增高约8倍(图4)。
[0050]实施例4MT_hASCs细胞移植动物模型实验
[0051]采用小鼠模型进行尾静脉注射，对与衰老评估相关的一些实验结果进行全面系统的分析。所有结果均使用Mcirosotf Execl2007软件进行统计分析。[0052]选取雌性小鼠40只，5周龄，体重20.5±lg。随机平分为4组，分组方案见表1。所有动物处于同一环境，10只/笼，条件为室温25°C士 2V，相对湿度40 — 70%,保持良好通风，自然光照明，正常饲喂至30d。
[0053]表1小鼠模型分组方案
【权利要求】
1.一种过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法,包括步骤: A)hASCs的获取、纯化及扩增； B)携带MT基因的腺相关病毒载体的构建； C)重组腺相关病毒载体感染hASCs，得到MT-hASCs。
2.如权利要求1所述的过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法，其特征是:所述的步骤A)包括: ADhASCs的分离和原代培养； A2) hASCs的传代培养与扩增； A3) hASCs的诱导分化。
3.如权利要求1所述的过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法，其特征是:所述的步骤B)包括: BI)将MT序列导入腺相关病毒载体得到rAAV-hMT ； B2)采用磷酸钙共沉淀法，将重组腺相关病毒载体、包装质粒、辅助质粒共转染到宿主细胞中，完成腺相关病毒包装和扩增。
4.一种生物制品，包括`米用权利要求1-3任一项所述的过表达金属硫蛋白的hASCs构建方法制备得到的MT-hASCs。
【文档编号】C12N5/10GK103695467SQ201310693542
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】姜舒, 罗朝霞, 刘颖斐, 曹娜, 黄文婷 申请人:深圳市茵冠生物科技有限公司