一种添加甜菜碱提高2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法
【专利摘要】本发明阐述了一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素C【技术领域】。采用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌系为生产菌株，通过在发酵培养基中外源添加0.05%～1.0%甜菜碱作为渗透压调节剂，促进细胞生长和2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的生产，实现2-KLG高效生产。本发明采用上述工艺，可有效缩短2-酮基-L-古龙酸的发酵周期，提高生产强度。
【专利说明】一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵制备维生素C【技术领域】，更具体地说，涉及一种添加甜菜碱提高
2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法。
【背景技术】
[0002]维生素C是人体必需的水溶性维生素，参与多种代谢活动。2-酮基-L-古龙酸酸(2-keto-L-gulonic acid,以下简称2-KLG)是合成维生素C重要的前体。目前国内主要维生素C生产厂家均采用“二步发酵法”生产工艺，这一技术的关键步骤是其第二步发酵过程，L-山梨糖在一种混合菌系作用下被生物氧化为2-KLG，该混合菌系由两种微生物组成，其中起糖酸转化作用的微生物为普通生酮基古龙酸菌，俗称小菌。混合菌系中另一种微生物为伴生菌，大多为革兰氏阳性芽孢杆菌，俗称大菌，如巨大芽孢杆菌等。在第二步发酵过程中，常出现生产前期大、小菌比例失调，大菌旺盛生长，发酵前期PH异常波动，小菌受到抑制，小菌不适应高浓发酵等现象，造成发酵周期长、能耗高等技术问题，因此，改进原有发酵生产工艺，提高2-KLG生产强度是非常必要的。
[0003]甜菜碱是一种中性物质，能够维持细胞渗透压，甜菜碱的溶解度很高，不带净电荷，其高浓度对许多酶及其他生物大分子没有影响，甚至有保护作用。目前通过添加甜菜碱来提高2-酮基-L-古龙酸生产强度尚未见文献报道。专利CN200910034773.0公开了一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，在发酵培养基中添加海藻糖，海藻糖作为渗透保护剂，提高耐高渗透能力；专利CN201010533043.8公开了一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产强度的方法，通过在发酵培养基中添加明胶提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产强度；专利CN201210314745.6公开`了一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，是通过在发酵培养基中添加D-核糖母液实现的。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产强度的方法，能够有效提高2-酮基-L-古龙酸的转化率，缩短发酵周期，实现高浓发酵。
[0005]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，采用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌系为生产菌株，以L-山梨糖为底物发酵，在发酵培养基中添加0.05%~1.0%的甜菜碱。
[0006]培养基条件为:
固体培养基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4^H 20 0.03,KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0007]液体种子培养基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4.H 20
0.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂 2.5，PH6.8-7.2。[0008]发酵培养基(％):山梨糖8.0，玉米浆0.5，尿素 1.2，MgS04.Η 20 0.02, KH2PO4 0.05,CaCO3 0.5，ΡΗ6.8-7.2，其中山梨糖单独灭菌。
[0009]本发明采用摇瓶培养方法培养菌种。
[0010]种液培养条件:培养温度28-30°C，培养时间为24小时，摇床转速200rpm。
[0011]发酵瓶培养条件:培养温度29-33°C，接种量12%，摇床转速210rpm，培养时间为72小时，发酵培养基中按实验要求添加不同浓度的甜菜碱(浓度范围0.05%~1.0%)。
[0012]用碘量法测定发酵液中的2-酮基-L-古龙酸；用二苯胺法测定发酵液中残余的L-山梨糖。
[0013]有益效果:本发明采用的上述工艺，发酵前期PH波动小，混合菌比例合适，菌种活力增强，2-酮基-L-古龙酸的生成速率大幅提高，可以有效缩短2-酮基-L-古龙酸的发酵周期，提高生产强度。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0015]本发明培养基:
固体培养基(％): 山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4^H 20 0.03,KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0016]液体种子培养基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4.H 20
0.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂 2.5，PH6.8-7.2。
[0017]发酵培养基(％):山梨糖8.0，玉米浆0.5，尿素 ^,MgSO4-H 20 0.02, KH2PO4 0.05,CaCO3 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖单独灭菌。
[0018]本发明摇瓶培养
种液培养条件:培养温度28-30°C，培养时间为24小时，摇床转速200rpm。
[0019]发酵瓶培养条件:培养温度29-33°C，接种量12%，摇床转速210rpm，培养时间为72小时，发酵培养基中按实验要求添加不同浓度的甜菜碱(浓度范围0.05%~1.0%)。
[0020]发酵液中2-KLG的测定:改进的碘量法；发酵液中残余的L-山梨糖测定:二苯胺法。
[0021]实施例1
将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液6ml，接入到40ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米浆、1.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾、0.5%碳酸钙、0.1%甜菜碱的发酵培养基，培养基初始PH7.0,培养温度29°C，摇瓶容积500ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量79.16mg/ml，发酵周期60小时，生产强度为1.32g/l*h。试验组与对照组相比发酵周期缩短了 9.1%，2-KLG产量和生产强度分别提高了 2.87%和14.2%。
[0022]实施例2
将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢菌的混合菌液12ml，接入到80ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米浆、1.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾。0.5%碳酸钙、0.5%甜菜碱的发酵培养基，培养基初始PH7.0，培养温度31°C，摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量79.72mg/ml，发酵周期56小时，生产强度为1.42g/l*h。试验组与对照组相比发酵周期缩短了 15.2%，2-KLG产量和生产强度分别提高了 2.96%和16.4%。[0023]实施例3
将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢菌的混合菌液12ml，接入到80ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米浆、1.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾。0.5%碳酸钙、0.2%甜菜碱的发酵培养基，培养基初始PH7.0，培养温度31°C，摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm。发酵12h后，每间隔4h补加0.02%甜菜碱至终点。发酵液终点2-KLG含量79.95mg/ml，发酵周期54小时，生产强度为1.48g/l*h试验组与对照组相比发酵周期缩短了 18.1%, 2-KLG产量和生产强度分别提高了 4.29%和19.1%。
[0024]显然，本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前体下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现 的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于:采用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌系为生产菌株，以L-山梨糖为底物发酵，在发酵培养基中添加0.05%~1.0%的甜菜碱。
2.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于:培养基条件为: 固体培养基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米浆0.5，尿素0.2，MgS04.H 20 0.03,KH2P04 0.02，CaC03 0.5，琼脂 2.5，PH6.8-7.2 ； 液体种子培养基(％):山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米浆0.5，尿素0.2,MgSCM-H 20 0.01，KH2P04 0.02，CaC03 0.5，琼脂 2.5，PH6.8-7.2 ； 发酵培养基(％):山梨糖 8.0，玉米浆 0.5，尿素 1.2，MgS04.H 20 0.02，KH2P04 0.05,CaC03 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖单独灭菌。
3.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于:米用摇瓶培养方法培养菌种。
4.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于:种液培养条件为:培养温度28-30°C，培养时间为24小时，摇床转速200rpm。
5.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于:发酵瓶培养条件为:培养温度29-33°C，接种量12%，摇床转速210rpm，培养时间为72小时。
6.如权利要求1所述 的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于:用碘量法测定发酵液中的2-酮基-L-古龙酸；用二苯胺法测定发酵液中残余的L-山梨糖。
【文档编号】C12P39/00GK103642889SQ201310693045
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】孔太, 胡少斌, 陈红, 刘杰 申请人:江苏江山制药有限公司