一种快速检测转基因大豆mon89788的实时荧光pcr方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测转基因大豆MON89788的实时荧光PCR方法，包括：制样与DNA提取、实时荧光PCR和结果判定等步骤，本发明建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR方法，提高了检测的灵敏度与特异性，检测灵敏度达到0.1%，缩短了实验时间，简化了实验操作，能够很好地适用于进出口和国内的转基因大豆MON89788及其制品的监测需求。同时，本发明中使用的阳性对照品是根据大豆内标准基因lectin与转基因大豆MON89788品系特异性序列设计的质粒标准分子，相对于传统的植物原材料标准物质，具有纯度高、易获得、经济高效等优点。
【专利说明】—种快速检测转基因大豆M0N89788的实时荧光PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，具体涉及一种快速检测转基因大豆M0N89788的实时荧光PCR方法。
【背景技术】
[0002]大豆是我国乃至全世界重要的经济与粮食作物，是食用油和植物蛋白最丰富、最廉价的来源。为了提高大豆的产量，满足人们对大豆的需求量，科研人员采用基因工程与分子辅助育种方法，培育了一些高产、优质和抗逆以及适合农场机械化种植的转基因大豆品种。国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)的年度报告显示，2012年，全球约81%的大豆产量为转基因大豆。上世纪末中国就已开始耐除草剂转基因大豆的进口，转基因大豆及其相关的加工产品越来越多地进入到食品与饲料链中。转基因作物在解决全世界日益严重的粮食危机的同时，也带来了食品安全和环境安全方面的诸多争议，世界各国都在逐步加强对重要目标食品中转基因大豆品系的监测与标识工作。
[0003]监测与标识工作的实施依赖于转基因产品检测技术，转基因检测技术包括蛋白质检测技术和核酸检测技术，其中实时荧光PCR技术，以其高特异性、高灵敏性和可定量等优点，越来越多的应用于转基因产品检测中。转基因生物的PCR检测主要是对转基因植物外源插入片段的选择性扩增。根据扩增的目标核酸的位置的不同，PCR检测策略可以分为四种，即筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测。与前三种方法相比，品 系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区DNA序列，具有非常高的特异性和准确性。品系特异性PCR检测已经成为目前转基因检测方法研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。
[0004]不论采用基于核酸或蛋白质的方法，在转基因检测时均必须使用标准物质作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测。目前，转基因作物及其产品检测所需的标准物质主要来源于植物原材料，但是这类标准物质制备、贮存和测定过程受很多因素影响，很难维持恒定的量，很难保证测量的稳定性，而且并非所有的转基因品系都存在标准物质，给转基因产品检测带来很大困难，同时也制约了转基因作物检测技术的发展。相比之下，标准分子在很多方面具有优势，标准分子是一种含有外源目的基因和内标准基因特异性片段的重组质粒分子，具有易获得，纯度高，经济高效等优点，近几年，质粒标准分子已逐渐成为一种可替代植物基因组DNA的一种标准物质，质粒标准分子的研制具有广阔的发展前景。
[0005]转基因大豆M0N8978品系是美国孟山都公司研发抗草甘膦大豆品种，已先后在美国、加拿大、日本和哥斯达黎加四国商业化种植，并在菲律宾、澳大利亚、新西兰、墨西哥等11个国家和地区批准用于食品和饲料加工原料。我国虽然不种植转基因大豆，但是每年进口几千万吨转基因大豆用于食品或饲料加工原料，转基因大豆M0N89788已于2011年批准进口我国用作加工原料。为加强转基因大豆M0N89788的安全监管，满足转基因标识的需要，有必要开发适用于转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测的方法。
【发明内容】
[0006]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速检测转基因大豆M0N89788的实时荧光PCR方法，使其检测灵敏度达到0.1%，并且可以同时进行大批量样品分析，能够很好地适用于进出口和国内的转基因大豆M0N89788及其制品的监测需求。
[0007]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
一种快速检测转基因大豆M0N89788的实时荧光PCR方法，包括以下步骤:
O制样与DNA提取
取大豆或其加工产品的样品，粉碎，用常规核酸提取方法提取DNA，确保DNA纯度应符合PCR检测要求；
2)实时荧光PCR
反应体系为 25μ L:2-5μ L 的 DNA 模板(100~200ng)，12.5μ L LightCycler 480Probes Master (商品化TaqMan实时突光定量PCR预混液(2X )中的一种),0.75 μ L引物M0N89788-FC10 μ mol/L),0.75 μ L 引物 M0N89788_R( 10 μ mol/L)，0.5 μ L 探针 Μ0Ν89788-Ρ(10 μ mol/L)，去离子水补齐体积；反应条件为:预变性95°C IOmin ;变性95°C 15s，退火延伸60°C lmin，45个循环；同时设置阴阳性对照与空白对照，阳性对照为质粒标准分子PMD19T-M0N89788,阴性对照 为非转基因大豆基因组DNA，空白对照为无菌水；
其中，引物与探针序为:引物 M0N89788-F:5，-CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3 ’，引物M0N89788-R:5’ -CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’ ；探针 M0N89788-P:FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQ I ;质粒标准分子pMD19T-M0N89788为克隆有SEQ ID N0.3所示序列的质粒；
3)结果判定
质控标准:空白对照无荧光增幅现象；阴性目标DNA对照无荧光增幅现象；阳性目标DNA对照检测Ct值小于或等于34 ;如有一项不符合者，重复步骤I)和2)。
[0008]结果判断:待测样品Ct值大于或等于40，设置的对照结果正常者，则判定该样品未检出转基因大豆M0N89788 ;待测样品Ct值小于或等于36，设置的对照结果正常者，则判定该样品检出转基因大豆M0N89788 ;待测样品Ct值在36~40之间，重复步骤2)，再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出转基因大豆M0N89788 ;再次扩增后结果Ct值大于40，且设置的对照结果正常，判定该样品未检出转基因大豆M0N89788。
[0009]所述的质粒标准分子pMD19T-M0N89788构建过程如下:
I)根据SEQ ID N0.1所示的转基因大豆M0N89788的品系特异性序列和SEQ ID N0.2所示的大豆内标准基因lectin特异性序列，基于PAS的方法，设计并合成出质粒标准分子的PCR引物，共计14条，具体如下:
引物 Al:5’ -CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’ ；
引物 A2:5，-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3，；
引物 A3:5，-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3，；
引物 A4:5’ -GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’ ；
引物 A5:5，-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3，；引物 A6:5’ -AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；
引物 A7:5，-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3，；
引物 A8:5，-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3，；
引物 A9:5，-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3，；
引物 AlO:5，-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3，；
引物 All:5，-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3，；
引物 A12:5，-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3，；
引物 A13:5，-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3，；
引物 A14:5’ -TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’。
[0010]2)将合成的14条引物分别稀释至IOpmol/μ L,引物Α2~Α13各取10 μ L，混合均匀后再稀释10倍作为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为:3^1^引物41，3111^引物八14，25 μ L SapphireAmp Fast PCR Master Mix(2X ), 12 μ L模板,ddH20补足体积至50 μ L ;PCR扩增条件:95°C,lmin ;94°C，30s，50°C，35s，72°C，40s，30 个循环；72°C,8min ;得到大豆内标准基因lectin片段和转基因大豆M0N89788的品系特异性片段连接在一起的重组DNA序列，长437bp序列，序列如SEQ ID N0.3所示；
3)回收酶切后的重组DNA序列及质粒载体pMD19-T，使用T4DNA连接酶16°C过夜反应，连接产物转化大肠杆菌DH5ci，进行蓝白斑筛选，筛选阳性克隆；连接反应体系为:
0.5μ L 卩顯19-1'载体，3.5 4 1^重组0嫩序列，14 1^ Τ4 DNA Ligase, I μ L 10ΧΤ4 DNA LigaseReaction Buffer, ddH20 补足体积至 10 μ L ;
4)按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒的说明书提取质粒标准分子pMD19T_M0N89788，测序验证；构建出质粒标准分子PMD19T-M0N89788，质粒标准分子置_20°C保存备用。
`[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明建立的转基因大豆M0N89788实时荧光PCR方法，提高了检测的灵敏度与特异性，检测灵敏度达到0.1%，缩短了实验时间，简化了实验操作，能够很好地适用于进出口和国内的转基因大豆M0N89788及其制品的监测需求。同时，本发明中使用的阳性对照品是根据大豆内标准基因与转基因大豆M0N89788品系特异性序列设计的质粒标准分子，相对于传统的植物原材料标准物质，具有纯度高、易获得、经济高效等优点。具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效应。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是质粒标准分子pMD19T-M0N89788构建中PAS方法的原理；
图2是构建的质粒标准分子pMD19T-M0N89788的示意图谱；
图3是转基因大豆M0N89788特异性实时荧光PCR检测方法特异性分析中转基因大豆M0N89788品系特异性序列扩增曲线图，图中，1:质粒标准分子pMD19T_M0N89788 ；2:转基因大豆M0N89788 ；3:转基因大豆A2704-12 ；4:转基因大豆A5547-127 ；5:转基因大豆GTS40-3-2 ；6:转基因玉米M0N810 ；7:转基因玉米T25 ；8:转基因玉米BT176 ；9:转基因玉米BTll ；10:转基因大米Bt63 ；11:转基因大米KF6 ；12:转基因油菜GT73 ；13:转基因油菜MS8 ；14:非转基因大豆；15:空白对照；
图4是转基因大豆M0N89788特异性实时荧光PCR检测方法灵敏度分析中转基因大豆M0N89788品系特异性序列扩增曲线图，图中，1:质粒标准分子pMD19T_M0N89788 ；2~4的转基因大豆M0N89788含量分别是1%、0.5%、0.1% ；5:空白对照。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明做进一步的说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件，或按制造厂商所建议的条件。
[0014]以下实施例所使用的主要材料、试剂与仪器具体如下:
转基因大豆 M0N89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2、转基因玉米 M0N810、T25、BT176、BT11、转基因大米Bt63、KF6转基因油菜GT73、MS8、非转基因大豆以及相关检测样品由江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心提供。
[0015]pMD19_T 载体、DL10000 DNA Marker>SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2X)、T4 DNA连接酶及缓冲液购自宝生物(大连)有限公司；DH5a感受态菌株、X_gal、氨苄青霉素(Amp)、IPTG、LB培养基购自北京天根生物技术有限公司；TaqMan实时荧光定量PCR预混液LightCycler 480 Probes Master (2X )购自南京莱普泰生物科技有限公司；质粒DNA提取采用Axygen公司的AxyPr印质粒DNA小量试剂盒(产品序号:AP-MN-P_50);植物组DNA提取采用北京天根生物技术有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP320-02);PCR引物与探针由上海辉睿生物技术有限公司合成；质粒测序由南京钟鼎生物技术有限公司完成；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。[0016]EPS-100电泳仪(上海天能科技有限公司)；基因扩增仪(9902型，AppliedBiosystems公司);AQE-183_2全自动凝胶成像系统(Syngene公司);Vorwerk搅拌器(德国Vorwerk公司)；GFL杂交炉(德国GFL公司)；J_E冷冻离心机(美国Beckman公司)；MB_102恒温震荡金属浴(日本Bioer公司)；NanoDrop 1000微量紫外分光光度计(美国Thermo公司);LightCyCler 480 II实时荧光PCR扩增仪(瑞士 Roche公司);其他仪器包括:培养箱、天平等。
[0017]实施例1:阳性对照品的构建
1、查阅国内外转基因定量检测标准，利用GenBank数据库进行生物信息学分析，获得转基因大豆M0N89788的品系特异性序列(SEQ ID N0.1)和大豆内标准基因lectin特异性序列(SEQ ID N0.2)。
[0018]2、构建质粒标准分子的PCR引物序列设计
根据犾得的转基因大? Μ0Ν8978的品系特异性序列彳目息和大?内标准基因lectin特异性序列信息，基于PAS (PCR-based Accurate Synthesis)的方法(基因合成原理如图1),设计并合成14条全长拼接引物，引物序列如下:
引物 Al:5’ -CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’ ；
引物 A2:5，-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3，；
引物 A3:5，-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3，；
引物 A4:5’ -GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’ ；
引物 A5:5，-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3，；引物 A6:5’ -AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；
引物 A7:5，-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3，；
引物 A8:5，-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3，；
引物 A9:5，-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3，；
引物 AlO:5，-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3，；
引物 All:5，-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3，；
引物 A12:5，-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3，；
引物 A13:5，-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3，；
引物 A14:5’ -TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’。
[0019]3、转基因大? M0N89788品系特异性序列和大?内标准基因的扩增
讲合成的14条引物分别稀释至IOpmol/μ L，引物Α2~Α13各取10 μ L，混合均匀后再稀释10倍作为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为:3μΙ^_Α1，3μΙ^_Α14，25μ?SapphireAmp Fast PCR Master Mix(2X ), 12 μ L 模板，ddH20 补足体积至 50 μ L。PCR 扩增条件:95°C,lmin ;94°C，30s，50°C，35s，72°C，40s，30 个循环；72°C，8min。得到大豆内标准基因lectin片段和转基因大豆M0N89788的品系特异性片段连接在一起的重组DNA序列，长437bp序列，序列如SEQ ID N0.3所示。
[0020]4、将PCR产物克隆至质粒载体pMD19-T上
使用T4 DNA连接酶连接重组DNA序列及质粒载体pMD19-T，16°C过夜反应，连接产物转化大肠杆菌DH5a，进行蓝白斑筛选，筛选阳性克隆。连接反应体系为:0.5μ L pMD19_T载体，3.5 μ L重组 DNA序列，IyL Τ4 DNA Ligase, I μ L 10ΧΤ4 DNA Ligase Reaction Buffer,ddH20补足体积至10 μ L,
5、质粒标准分子DNA提取
按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒的说明书提取质粒标准分子pMD19T_M0N89788，送去测序验证。紫外分光光度计测定结果表明，提取的质粒标准分子DNA的OD26tZOD28tl接近
1.8，符合PCR检测的要求，质粒标准分子置-20°C保存备用。本发明构建的质粒标准分子PMD19T-M0N89788的简要图谱如图2所示。
[0021]实施例2:转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测方法的建立
1、制样与DNA提取
称取约200g大豆及其加工产品样品，在经已去除交叉污染的合适粉碎装置中，将样品均质为粉末颗粒大小约0.5mm。使用相关核酸提取方法提取f 2g样品DNA，DNA纯度应符合PCR检测要求。
[0022]2、转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测的引物与探针的设计
根据获得转基因大豆M0N89788品系特异性序列，应用Primer Premier 5.0软件设计出特异性引物和探针。具体的引物与探针序如下:引物M0N89788-F:5’ -CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3’，引物 M0N89788-R:5’ -CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’ ；探针M0N89788-P:5’ -FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQ1-3’。
[0023]3、转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测方法的建立
反应体系为254 1^，包括2-54 1^的0嫩模板(100~2001^)，12.5“1^ LightCycler 480Probes MasterC 2 X )，0.75 μ L正向引物(引物浓度10 μ mol/L)、0.75 μ L反向引物(引物浓度10μπιΟ1/υ，0.5yL探针(探针浓度lOymol/L)，去离子水补齐体积。反应条件为:预变性95°C IOmin ;变性95°C 15s，退火延伸60°C lmin，45个循环。
[0024]同时设置阴阳性对照与空白对照，阳性对照为质粒标准分子PMD19T-M0N89788，阴性对照为非转基因大豆基因组DNA，空白对照为无菌水。
[0025]4、转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测方法的结果判定
(I)结果分析条件设定
阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。
[0026](2)质控标准
空白对照:无荧光增幅现象。
[0027]阴性目标DNA对照:无荧光增幅现象。
[0028]阳性目标DNA对照:检测Ct值小于或等于34。
[0029]上述指标有一项不符合者，应重做实时荧光PCR扩增。
[0030](3)结果判断
PCR检测时应做平行实验，两份平行测试样品的结果应保持一致。如果一个测试样品的结果为阳性而另一个为阴性时，应重新进行检测。
[0031]待测样品Ct值大于或等于40，设置的对照结果正常者，则可判定该样品未检出转基因大豆M0N89788 ；
待测样品Ct值小于或等于36，设置的对照结果正常者，则可判定该样品检出转基因大豆 M0N89788 ；
待测样品Ct值在36~40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出转基因大豆M0N89788 ;再次扩增后结果Ct值大于40，且设置的对照结果正常，可判定该样品未检出转基因大豆M0N89788。
[0032]应用上述建立的转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测方法，对江苏进口的70多批申报为含有转基因大豆M0N89788的货物进行了检测，转基因大豆M0N89788检测结果均为阳性，符合申报内容。同时对出口或进行质控的30个以上大豆及其加工品进行转基因大豆M0N89788检测，检测结果均为阴性。此外参加了中美大豆联合查验工作中的转基因大豆品系项目的检测，相同的比对检测样品转基因大豆M0N89788检测结果均为阳性。
[0033]实施例3:转基因大豆M0N89788实时荧光PCR检测方法特异性试验
使用TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因大豆M0N89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2、转基因玉米 M0N810、T25、BT176、BT11、转基因大米 Bt63、KF6 转基因油菜GT73、MS8等基因组DNA，使用建立的实时荧光PCR方法扩增转基因大豆M0N89788品系特异性序列，每个样品做双平行，同时设置阴阳性对照与空白对照，阳性对照为质粒标准分子pMD19T-M0N89788，阴性对照为非转基因大豆基因组DNA，空白对照为无菌水。
[0034]结果如图3所示，只有转基因大豆M0N89788基因组DNA与阳性对照成功扩增出转基因大豆M0N89788品系特异性序列，其他11种DNA样本及阴性对照、空白对照在45个循环内没有出现实时荧光扩增曲线。可见，针对转基因大豆M0N89788品系特异性序列的引物与探针特异性良好。
[0035]实施例4:转基 因大豆M0N89788实时荧光PCR检测方法灵敏度试验将研磨好的纯合M0N89788品系大豆和非转基因大豆干粉按照质量百分比进行混合，配制3个不同转基因含量样品，包括1%、0.5%和0.1%，使用TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒提取各组DNA，样品DNA稀释至50ng/ μ L，加入2 μ L DNA模板，使用建立的实时荧光PCR方法扩增转基因大豆Μ0Ν89788品系特异性序列，每个样品3次重复，同时设置阴阳性对照，阳性对照为质粒标准分子PMD19T-M0N89788，阴性对照为无菌水。
[0036] 结果如图4所示，当荧光定量PCR体系中转基因大豆Μ0Ν89788含量为1%、0.5%和0.1% (100大豆基因组DNA)时，存在明显的扩增曲线，所得Ct值分别为31.94±0.15、33.90±0.08、35.84±0.51，Ct值均小于36。结果表明当转基因含量为0.1%时扩增良好，即建立的转基因大豆Μ0Ν89788实时荧光PCR检测方法灵敏度可达0.1%，能满足实际检测需要。
【权利要求】
1.一种快速检测转基因大豆M0N89788的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤: O制样与DNA提取 取大豆或其加工产品的样品，粉碎，用常规核酸提取方法提取DNA，确保DNA纯度应符合PCR检测要求； 2)实时荧光PCR
反应体系为 25 μ L:2_5 μ L 的 DNA 模板，12.5 μ L LightCycler 480 Probes Master,0.75 μ L 引物 M0N89788-F、0.75 μ L 引物 M0N89788-R，0.5 μ L 探针 Μ0Ν89788-Ρ，去离子水补齐体积；反应条件为:预变性95°C IOmin ;变性95°C 15s，退火延伸60°C lmin，45个循环；同时设置阴阳性对照与空白对照，阳性对照为质粒标准分子PMD19T-M0N89788，阴性对照为非转基因大豆基因组DNA，空白对照为无菌水； 其中，引物与探针序为:引物 M0N89788-F:5，-CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3 ’，引物M0N89788-R:5’ -CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’ ；探针 M0N89788-P:FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQI ;质粒标准分子pMD19T-M0N89788为克隆有SEQ ID N0.3所示序列的质粒； 3)结果判定 质控标准:空白对照无荧光增幅现象；阴性目标DNA对照无荧光增幅现象；阳性目标DNA对照检测Ct值小于或等于34 ;如有一项不符合者，重复步骤I)和2)； 结果判断:待测样品Ct值大于或等于40，设置的对照结果正常者，则判定该样品未检出转基因大豆M0N89788 ;待测样品Ct值小于或等于36，设置的对照结果正常者，则判定该样品检出转基因大豆M0N89788 ;待测样品Ct值在36~40之间，重复步骤2)，再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出转基因大豆M0N89788 ；再次扩增后结果Ct值大于40，且设置的对照结果正常，判定该样品未检出转基因大豆M0N89788。
2.根据权利要求1所述的快速检测转基因大豆M0N89788的实时荧光PCR方法，其特征在于，所述的质粒标准分子PMD19T-M0N89788构建过程如下:
I)根据SEQ ID N0.1所示的转基因大豆M0N89788的品系特异性序列和SEQ ID N0.2所示的大豆内标准基因lectin特异性序列，基于PAS的方法，设计并合成出质粒标准分子的PCR引物，共计14条，具体如下:
引物 Al:5’ -CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’ ；
引物 A2:5，-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3，；
引物 A3:5，-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3，；
引物 A4:5’ -GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’ ；
引物 A5:5，-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3，；
引物 A6:5’ -AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；
引物 A7:5，-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3，；
引物 A8:5，-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3，；
引物 A9:5，-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3，；
引物 AlO:5，-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3，；
引物 All:5，-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3，；引物 A12:5，-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3，；
引物 A13:5，-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3，；
引物 A14:5’ -TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’ ； 2)将合成的14条引物分别稀释至10?11101/^1^，引物42113各取10μ L，混合均匀后再稀释10倍作为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为:3yL引物Al，3yL引物A14，25yLSapphireAmp Fast PCR Master Mix (2X ), 12 μ L 模板，ddH20 补足体积至 50 μ L ;PCR 扩增条件:95°C,lmin ;94°C，30s，50°C，35s，72°C，40s，30 个循环；72°C,8min ;得到大豆内标准基因lectin片段和转基因大豆MON89788的品系特异性片段连接在一起的重组DNA序列，长437bp序列，序列如SEQ ID N0.3所示； 3)回收酶切后的重组DNA序列及质粒载体pMD19-T，使用T4DNA连接酶16°C过夜反应，连接产物转化大肠杆菌DH5ci，进行蓝白斑筛选，筛选阳性克隆；连接反应体系为:.0.5μ L PMD19-T载体，3.5μ L重组DNA序列，I μ L Τ4 DNA Ligase, I μ L 10ΧΤ4 DNA LigaseReaction Buffer, ddH20 补足体积至 10 μ L ； 4)按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒的说明书提取质粒标准分子pMD19T_M0N89788，测序验证；构建出质粒标准分子PMD19T-M`0N89788，质粒标准分子置_20°C保存备用。
【文档编号】C12Q1/68GK103725777SQ201310693528
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】黄明, 刘欣, 祝长青, 黄继超, 周兴虎 申请人:南京佳邦食品有限公司