一种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉jp-nj2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2及其应用，该马尾松根际解磷真菌的分类命名为瓜纳卡斯特青霉（Penicilliumguanacastense）JP-NJ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC?No：M2013476，保藏日期为：2013年10月17日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。本发明的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2具有的优势包括：对难溶性无机磷酸盐磷酸三钙、磷酸铝和磷酸铁具有较好的溶解能力；对难溶性有机磷卵磷脂具有较好的溶解能力；对有机磷农药草甘膦具有良好的生物降解功能；通过盆栽试验证实菌剂接种马尾松苗可以明显促进马尾松的生长。因此，本发明的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。
【专利说明】—种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉(Penicillium guanacastense) JP-NJ2 及其应用。
【背景技术】
[0002]马尾松是我国重要的造林先锋树种。磷是植物生长发育所需的大量和限制性元素之一，磷可以加速苗木的生长，并在一定程度上提高苗木的抗逆性和抗病性。由于土壤中磷素的供应不足，导致我国南方地区许多马尾松人工林生长不良，生物量下降，衰退现象较严重。在自然条件下，土壤中90%以上的磷为无效磷，植被难以直接吸收利用，施入的磷肥又多与土壤中金属离子结合形成难溶性磷酸盐，同时磷肥过多施用会导致水体富营养化，破坏生态平衡。目前，通过以解磷微生物肥料来提高林地土壤磷的利用率成为人们关注的热点之一 O
[0003]土壤中能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态的微生物称为解磷微生物(phosphate-solubilizing microorganisms, PSMs),其种类包括真菌、细菌及放线菌等。研究表明解磷真菌(Solubilizing phosphorus fungus)在数量和种类上都少于解磷细菌，但解磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌，甚至是细菌的几十倍，且遗传性状更加稳定，同时解磷真菌还可在一定程度上促进植株生长，在微生物肥料应用方面具有极大潜力。然而目前对解磷真菌的研究很少，且主要筛选自农作物根际土壤，从林地生态系统进行筛选研究及报道较少。目前，如何挖掘土壤磷库资源，提高土壤中磷的利用效率是我国林业生产中急需解决的问题。因此，从林地根际土壤中筛选高效解磷真菌，是改善林地土壤养分，促进松树生长的一条有效途径。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2，其具有较强的解磷能力。本发明的另一目的是提供一种上述马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在促进马尾松苗生长中的应用。
[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0006]—种马尾松根际解磷真菌，其分类命名为瓜纳卡斯特青霉(PeniciIIiumguanacastense) JP-NJ2,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCN0:M2013476，保藏日期为:2013年10月17日，保藏地址为:中国武汉，武汉大学。
[0007]所述的马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在促进马尾松苗木生长中的应用。
[0008]所述的马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在溶解难溶性无机磷酸盐及难溶性有机磷中的应用。
[0009]所述的无机磷酸盐包括磷酸铝、磷酸铁和磷酸钙。[0010]所述的有机磷包括卵磷脂和草甘膦。
[0011]瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2，是从江苏省林业科学研究院内50年生马尾松的根际土壤中筛选获得的。
[0012]JP-NJ2的生物学特征JP-NJ2菌株在CYA培养基上25°C培养7d，菌落直径33mm左右，近于平坦，质地呈絮状兼绒状，有时有规则的放射状皱纹，分生孢子面呈灰绿色，近于烟灰色，中间部分呈现橘褐色，渗出液少量，黄褐色(图1);菌落反面呈橘黄色(图2)。分生孢子梗具帚状分枝，分生孢子球形或近球形。
[0013]菌落在NBRIP培养基上，25 °C培养7d，菌落直径20_23mm之间，溶磷圈直径32-38mm之间。菌落较为平坦，质地呈絮状，中间呈烟灰色；菌落中间菌丝密集，有大量孢子产生，菌落外围分生孢子较少，较稀疏，呈现橘黄色(图3 );整个菌落反面呈橘黄色(图4 )。
[0014]JP-NJ2菌株18SrDNA ITS序列，见SEQ ID N0.1所示。将序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，JP-NJ2菌株与Penicillium guanacastense的相似度为95%。结合形态特征和18SrDNA ITS序列分析，JP-NJ2菌株鉴定为瓜纳卡斯特青霉(Penicillium guanacastense) JP-NJ2。
[0015]上述的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2对磷酸三钙具有很强的解磷能力。菌剂盆栽接种试验表明，JP-NJ2菌株可将土壤中难溶性无机磷转变为有效态磷供马尾松苗木吸收利用，明显促进马尾松苗木的生长。
[0016]有益效果:与现有技术相比，本发明的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2具有的优势包括:对难溶性无机磷酸盐磷酸三钙(Ca3 (PO4) 2)、磷酸铝(AlPO4)和磷酸铁(FePO4.4H20)具有较好的溶解能力；对难溶性有机磷卵磷脂具有较好的溶解能力；对有机磷农药草甘膦具有良好的生物降解功能；通过盆栽试验证实菌剂接种马尾松苗可以明显的促进马尾松的生长。因此，本发明的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是JP-NJ2菌株在CYA培养基上生长7d的菌落特征正面图；
[0018]图2是JP-NJ2菌株在CYA培养基上生长7d的菌落特征反面图；
[0019]图3是JP-NJ2菌株在NBRIP培养基上生长7d的菌落特征正面图；
[0020]图4是JP-NJ2菌株在NBRIP培养基上生长7d的菌落特征反面图；
[0021]图5是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时对4种不同磷源的溶解能力结果图；
[0022]图6是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时对4种不同磷源的解磷率结果图；
[0023]图7是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时解无机磷能力和pH值的动态变化结果图；
[0024]图8是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时解有机磷卵磷脂能力和pH值的动态变化结果图；
[0025]图9是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时对草甘膦降解率的动态变化结果图；
[0026]图10是JP-NJ2菌 株对马尾松苗生长的影响结果图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0028]以下实例中，PDA培养基的配方为:马铃薯20g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。CYA培养基的配方为=K2HPO4L Og，查氏浓缩液10mL，酵母膏5g，蔗糖30g，琼脂15g,蒸馏水1000mL0磷酸盐生长培养基(NBRIP)的配方为:葡萄糖10g, Ca3 (PO4)25g,MgCl2.6H205g, KC10.2g, MgSO4.7Η200.25g, (NH4)2SO40.1g,蒸馏水 1000mL, ρΗ7.0。解磷培养基A的配方为:用磷酸铝(AlPO4)代替NBRIP中的Ca3 (PO4)2，其他成分和含量相同。解磷培养基B的配方为:用磷酸铁(FePO4.4Η20)代替NBRIP中的Ca3 (PO4)2，其他成分和含量相同。解磷培养基C的配方为:用磷酸氢钙(CaHPO4.2Η20)代替NBRIP中的Ca3 (PO4)2，其他成分和含量相同。蒙金娜培养基的配方为:蔗糖10g, (NH4)2SO40.5g，MgSO4.7Η200.3g，KC10.3g，FeSO4.7Η200.03g, MnSO4.7Η200.03g，卵磷脂 0.6g, CaC035g，蒸馏水 1000mL, ρΗ7.2。草甘膦培养基的配方为:用草甘膦代替蒙金娜培养基中的卵磷脂，其他成分和含量相同。
[0029]实施例1JP-NJ2菌株解磷试验
[0030]将瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2菌株接种到PDA平板上，培养IOd后，用灭菌的打孔器在平板取菌块(直径6mm)分别接种到装有50mL NBRIP液体培养基及解磷液体培养基A、B、C的IOOmL的三角瓶中，分别以相同体积未接菌的解磷培养基为对照(CK)，每瓶接种6个菌块，每个待测菌株设三个重复，250C，200r -min^1振荡培养，7d后，将发酵液离心IOmin (4°C，1000Or MirT1);采用磷钥蓝分光光度法，即取上述离心得到的上清液IOOuL加入50mL的容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水后，再加1-2滴2，4- 二硝基酚指示剂，再加5mL钥锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，测定OD值。并计算上清液中的有效磷含量和解磷率。结果如表1及图5、图6所示。其中，解磷率(％)=(接菌可溶性磷含量一对照可溶性磷含量)/加入磷酸盐的量X 100。
[0031]表1JP-NJ2菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝和磷酸氢钙的溶解能力
[0032]
【权利要求】
1.一种马尾松根际解磷真菌，其分类命名为瓜纳卡斯特青霉iPenicilliumguanacastense ) JP-NJ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2013476，保藏日期为:2013年10月17日，保藏地址为:中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在促进马尾松苗木生长中的应用。
3.权利要求1所述的马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在溶解难溶性无机磷酸盐及难溶性有机磷中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的无机磷酸盐包括磷酸铝、磷酸铁和磷酸钙。
5.根据权利 要求3所述的应用，其特征在于:所述的有机磷包括卵磷脂和草甘膦。
【文档编号】C12N1/14GK103789214SQ201410004110
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】吴小芹, 乔欢, 魏伟, 叶建仁 申请人:南京林业大学