一种基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法
【专利摘要】本发明是一种基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，具体是：水样预处理；通过玻璃纤维膜预过滤水样；利用混合纤维素酯膜富集水样中的甲肝病毒；提取病毒RNA，反转录，制作标准曲线；利用荧光定量PCR检测甲肝病毒；计算甲肝病毒富集效率。本发明方法构思合理，装置操作简单、轻便，适于实验室操作和野外作业；省去了常规的加入洗脱剂洗脱病毒和加入有机或无机絮凝沉淀剂沉淀病毒的二次浓缩，体积可浓缩约250倍；特别是富集效率高，PBS水样中富集效率平均达(92.62±5.17)%，东湖水样中富集效率平均也可达(79.45±12.10)%。本方法对于各种环境水体中的甲肝病毒高效精确的检测与监控具有重要意义。
【专利说明】一种基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析测试和环境监测【技术领域】，具体涉及一种基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法及应用，它利用混合纤维素酯膜富集水样中的病毒，又采用实时荧光定量PCR检测其拷贝数，以提高检测水体中病毒污染的灵敏度。
【背景技术】
[0002]近年来，随着环境污染越来越严重，由于水体传播引发的病原性疾病已成为世界范围内人们所关注的问题之一。目前，许多国家包括中国都采用粪便污染指示菌，例如粪大肠菌群、总大肠菌群、肠球菌来评价水体的污染状况。我国现行的《生活饮用水标准》(GB5742-2006)和废水再利用文件《再生水水质标准》(SL368-2006)的微生物污染指示栏中也只是包含了细菌和寄生虫的测定标准，而没有包括水体病毒的检测。但是研究发现，水环境中细菌水平与病毒浓度之间无明显相关(Tree, Adams et al.2003),并且有些病毒对外界环境和消毒作用的抵抗力更强，细菌指示的使用不足以对已处理水质或水体的污染状况进行检测或评价，在满足水体细菌卫生学标准时仍能检测到病毒。水环境与人们的生活、生产息息相关，其病毒安全性应该引起学界及有关部门的高度重视。
[0003]与水体污染有关的致病病毒主要包括细小RNA病毒科的脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、甲肝病毒、埃可病毒、肠道病毒68-71型；杯状病毒科的诺如病毒；腺病毒科的人腺病毒；呼肠孤病毒的轮状病毒等。其中甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)感染占我国急性病毒性肝炎的首位。甲型肝炎病毒隶属于小RNA病毒科肝病毒属，病毒颗粒无囊膜，呈二十面体对称结构，直径为27nm-32nm，其中包含一条正链RNA基因组，长度为约7.5kb。甲肝病毒主要通过粪口途径传播，人群普遍易感，是一种高发病率的肠道传染病病毒。食用被污染的水或食物及人与人之间的密切接触是最主要的传播方式，肠道外传播也偶见报道。半数以上甲肝病毒感染是未知起源的，被污染的水或食物特别是贝类被认为是危险因素之一 (Guevremont, Brassard et al.2006)(Brassard, Seyer et al.2005)(Nainan, Xia etal.2006)。
[0004]甲肝病毒虽不易导致慢性感染，但常可造成暴发流行，给国家和人民的生命财产造成重大损失。世界各国每年都有关于甲型肝炎的报道。在我国，甲肝流行时有发生，1988年，上海爆发了一次医学史上规模最大的甲肝大流行，由食用遭甲型肝炎病毒污染水体中养殖的毛蚶造成。2003年，重庆市垫江县长龙乡长久村小学出现甲肝疫情，53名学生被确诊为甲肝患者，甲肝爆发的原因是学生饮用水源被污染，学生喝了不洁饮用水。2008年广西接连发生2起甲肝疫情，造成约200名学生被感染，经疾控人员调查，引发疫情的原因都是学校的饮用水源受到了污染。2008年贵阳暴发甲型肝炎疫情，111名学生因饮用被污染的竹园牌桶装矿泉水而感染甲型肝炎。近年来，我国出口美国的贝类曾被多次检测出甲肝病毒而被列为禁入产品，对我国的国际形象造成了极大地损害。所以食物及环境中甲肝病毒的检测及溯源研究十分重要。
[0005]直接对病毒进行检测可以提供更可靠的水体病毒污染信息，进一步确保用水安全。但是，迄今国内外尚未制定统一可行的水中病毒学检测方法，根本原因在于其技术难度高、费用昂贵、工作量大，涉入门槛高，基础科研数据积累少。
[0006]仅就技术而言，从污染的水中检测甲肝病毒，有一定检测限度，这是因为水体环境中病毒浓度比临床病人感染样本中病毒浓度低得多，临床上使用的最灵敏的病毒检测方法在水体环境中也不适用。只有通过不同技术手段，将水样中的病毒在前期处理过程中进行有效浓缩，最终才能够捕获致病微生物并还原出原始感染模型。因此，要开展水体中病毒的检测研究，必须解决水体中病毒的富集问题。
[0007]世界各国对如何从水体中有效富集病毒进行了大量探索(Haramoto, Katayamaet al.2004) (ffestrell,Teunis et al.2006) (Villar,de Paula et al.2006)(Haramoto, Katayama et al.2007),美国和欧盟也颁布了相应的指导性文件，如美国的D524492、9510以及欧盟的BS EN14486:2005等。总而言之，对病毒的富集浓缩主要有以下几种方法:滤膜吸附法，絮凝沉淀法，免疫学法，超滤法，此外还有超速离心、电泳等，虽然可供选择的病毒富集方法多种多样，但效果均不太理想。目前，实际应用中最常用到的是滤膜吸附法。滤膜吸附法包括正电滤膜吸附法、负电滤膜吸附法、不带电滤膜吸附法。在多价阳离子存在和PH较低的条件下，水体中的病毒可吸附在负电性的滤膜上，这是病毒、滤膜和阳离子之间静电引力和疏水相互作用的结果(Lukasik, Scott et al.2000)。而正电滤膜吸附法是通过带负电的病毒粒子与带正电的滤膜直接结合。不带电荷的滤膜如硝酸纤维素滤膜，吸附能力强，能够与蛋白质等生物大分子结合，可用于蛋白质包括有蛋白质包裹的病毒颗粒的分离。吸附在滤膜上的病毒可用碱性牛肉浸出液洗脱，但牛肉浸出液中的有机和无机化合物会对病毒进一步的检测造成影响(Schwab, De Leon et al.1995)。本发明将对滤膜吸附法的工艺流程进行优化，致力于提供一种水体中甲肝病毒快速、简便、富集效率高的富集方法。
[0008]水体样 本中病毒含量比较低，常规的PCR或半数组织细胞感染量(TCID50)方法的灵敏度不够，造成对甲肝病毒检测不准确。而荧光定量PCR通过在反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号来实现对整个PCR过程的实时监测，最后用标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，具有实时监测，定量准确，灵敏度高、重复性好等优点，广泛用于病原微生物的检测。
[0009]由于各种富集方法中材料和材质的理化性质、吸附-洗脱条件、操作流程不同，导致不同富集方法结果也相差悬殊，各国也不具可比性。因此，对甲肝病毒的整个富集过程的进行优化，提高病毒的富集效率，在我国建立一种对甲肝病毒快速而有效的富集和检测方法，对保证饮水和食品安全，减少肝病毒感染，保证人民生命健康，以及对甲肝病的预防和控制具有重要的理论和实践意义。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种便捷、准确、高效的水体中甲肝病毒的富集方法，它以水体中污染的甲肝病毒为对象，利用较简便的富集装置，实现了水体中甲肝病毒的富集，为水体环境中的甲肝病毒高效快速的检测与监控以及人们对甲肝病毒的防控提供技术支持。
[0011]本发明解决其技术问题采用以下的技术方案:
[0012]本发明提供的基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其步骤包括:[0013](I)水样预处理:
[0014]500ml水样加入PBS成分并用HCl调节溶液ρΗ7.2-7.4，以4°C，3800g，离心15min，
去除水中大颗粒杂质及藻类植物；上清液用装有孔径2.7 μ m玻璃纤维膜的过滤器负压抽滤，进行预过滤；
[0015](2)利用混合纤维素酯膜富集水样中的甲肝病毒:
[0016]富集装置包括真空泵、连接管、过滤器和滤膜，其中:真空泵通过连接管与过滤器连通，滤膜固定在过滤器中；
[0017]预过滤液用装有孔径0.1 μ m混合纤维素酯膜的过滤器负压抽滤；取出滤膜，放入平皿，无需将滤膜上的病毒洗脱，直接加入2ml Trizol浸泡滤膜5-10min，然后用2个EP管分装以提取核酸，省去了常规富集水样中病毒二次浓缩的操作；
[0018](3)提取病毒RNA，反转录，制作标准曲线:
[0019]提取甲肝病毒RNA，反转录成cDNA，同时用含有甲肝病毒基因VP1-VP3衣壳蛋白保守区域目的片段的质粒标准分子制作标准曲线；
[0020](4)荧光定量PCR检测水体富集的甲肝病毒拷贝数；
[0021](5)根据以下公式计算甲肝病毒富集效率:
[0022]
【权利要求】
1.一种基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)水样预处理: 500ml水样加入PBS成分并用HCl调节溶液ρΗ7.2-7.4，以4°C，3800g,离心15min,去除水中大颗粒杂质及藻类植物；上清液用装有孔径2.7 μ m玻璃纤维膜的过滤器负压抽滤，进行预过滤； (2)利用混合纤维素酯膜富集水样中的甲肝病毒: 富集装置包括真空泵、连接管、过滤器和滤膜，其中:真空泵通过连接管与过滤器连通，滤膜固定在过滤器中； 预过滤液用装有孔径0.1ym混合纤维素酯膜的过滤器负压抽滤；取出滤膜，放入平皿，无需将滤膜上的病毒洗脱，直接加入2ml Trizol浸泡滤膜5-10min，然后用2个EP管分装以提取核酸； (3)提取病毒RNA，反转录，制作标准曲线: 提取甲肝病毒RNA，反转录成cDNA，同时用含有甲肝病毒基因VP1-VP3衣壳蛋白保守区域目的片段的质粒标准分子制作标准曲线； (4)荧光定量PCR检测水体富集的甲肝病毒拷贝数； (5)计算甲肝病毒富集 效率。
2.如权利要求1所述的基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述 PBS 成分为:137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KClUOmmol/L Na2HPO4 和 2mmol/L ΚΗ2Ρ04。
3.如权利要求1所述的基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的水样预处理，PBS水样是由ddH20配制，无需进行离心去除杂质、无需使用玻璃纤维膜预过滤。
4.如权利要求1所述的基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的孔径2.7 μ m玻璃纤维膜和孔径0.1 μ m混合纤维素酯膜分别采用英国Whatman和美国Millipore公司的微孔滤膜。
5.如权利要求1所述的基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的直接加入2ml Trizol浸泡滤膜5_10min，省去了常规富集水样中病毒二次浓缩的操作。
6.如权利要求1所述的基于混合纤维素酯膜富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的所有步骤使用的水样采集容器、病毒富集容器进行消毒灭菌处理。
7.权利要求1至6中任一权利要求所述方法的应用，其特征是该方法在水体中甲肝病毒的富集和检测中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK103789275SQ201410037633
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】陈全姣, 乔煜婷, 隋志伟, 高志敏, 赵丽华 申请人:中国科学院武汉病毒研究所