一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体为检测人表皮生长因子受体基因EGFR外显子19缺失突变的PCR引物、TaqMan探针、PNA探针及试剂盒和检测方法；以数字PCR为平台，在反应体系中加入与野生型非突变模板序列互补的PNA探针，利用PNA探针的阻遏作用，使得只有发生了EGFR外显子19缺失突变的样本才能被扩增；并且利用TaqMan探针作为荧光定量标记，根据荧光检测判断样品中是否存在突变的模板及数量和比例。
【专利说明】—种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域和核酸检测领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子19缺失突变的方法。
【背景技术】
[0002]随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因突变可以给医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。
[0003]表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶区域发生突变，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率达到80%以上。由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。
[0004]EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18_24编码，其中外显子18_20编码N-Lobe，外显子21~24编码C_Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21 ;非小细胞肺癌EGFR突变90%以上发生为exonl9的缺失突变及exon21的L858R点突变。
[0005]尤其是人表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子19发生突变的非小细胞肺癌患者，对该类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。外显子19缺失突变占约46%，主要是发生9、12、15、18、24个核苷酸的框内缺失突变。因此EGFR外显子exonl9缺失突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
[0006]目前基因变异的检测技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法。现分别简介于下:
[0007]Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应(PCR)。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP，ddGTP, ddCTP, ddTTP (4种双脱氧核糖核苷酸)荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%~20%以上的突变。
[0008]ARMS 法也称扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)、等位基因特性PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)等，即等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplif ication, ASA)建立于 1989 年,是 PCR 技术应用的发展。
[0009]ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增野生型或突变型基因。
[0010]上述现有技术存在以下问题:
[0011]1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测。
[0012]2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。
[0013]3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。
[0014]目前的检测一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法，用于癌症患者，特别是肺癌患者的靶向用药指导、高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测等。
【发明内容】
[0015]本发明的目的在于提 供一种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及方法，为个体化用药提供参考。
[0016]肽核酸(P印tide Nucleic Acid, PNA)是一类以中性酰胺键(假肽键)代替DNA中的糖-磷酸二酯键作为骨架的脱氧核糖核酸类似物，保留其中的碱基部位。PNA的特殊结构，使之可以不被蛋白酶或者核酸酶降解，有很高的稳定性，是一种非离子、非手性、不易被水解和酶切的分子。
[0017]PNA与DNA模板结合能力高于普通寡核苷酸，可作为阻遏物置于引物前面，并与PCR引物部分重合；SPNA与模板正确配对时可阻止聚合酶链反应，野生型模板无法扩增；若发生错配(例如模板为发生突变的DNA)，则结合能力迅速下降，失去阻遏作用。此时可用来扩增突变模板。
[0018]数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于I个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
[0019]本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入与野生型非突变模板序列互补的PNA探针，利用PNA探针的阻遏作用，使得只有发生了 EGFR外显子19缺失突变的样本才能被扩增；并且利用TaqMan探针作为荧光定量标记，根据荧光检测判断样品中是否存在突变的模板。
[0020]本发明技术方案如下。
[0021]一种检测EGFR外显子19缺失突变的PCR扩增引物，为反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物，可扩增含有EGFR外显子19上c.2230-c.2260序列的片段；正向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.1~5)中的一种:
[0022]F1:5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
[0023]F2:5 ’ -GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，
[0024]F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3，，
[0025]F4:5 ’ -GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0026]F5:5， -AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，；
[0027]反向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.6~10)中的一种；
[0028]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
[0029]R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
[0030]R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
[0031 ] R4:5，-CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
[0032]R5:5，-CCACAC AGCAAAGCAGAA-3，。
[0033]优选的，正向PCR扩增引物为SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列；反向PCR扩增引物为SEQ ID N0.6~10之一的核苷酸序列；
[0034]更优选的，PCR扩增引物选自以下各组序列之一:
[0035](I)正向:F1:5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3 ’，
[0036]反向Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3 ’，或者，
[0037](2 )正向:F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’，
[0038]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’，或者，
[0039](3 )正向:F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’，
[0040]反向R3:5 ’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，或者，
[0041 ] (4 )正向:F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0042]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’，或者，
[0043](5 )正向:F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，，
[0044]反向R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3 ’。
[0045]一种检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，能够与缺失位点下游的DNA模板结合，是连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其中荧光基团选自6-羧基荧光素、六氣 _6_ 竣基突光素、Cy5 (美国 Life Technologies)、Cy3 (美国 Life Technologies)或VIC (美国Life Technologies)，猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQl (美国LifeTechno1gies)>BHQ2 (美国 Life Technologies)或 MGB (美国 Life Technologies);标记TaqMan探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种(SEQ ID N0.11~15):
[0046]P1:5，-ACTCACATCGAGGATTTCC-3’，
[0047]P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
[0048]P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
[0049]P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
[0050]P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0051]优选的，这种检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针的核苷酸部分是SEQ ID N0.11~15核昔酸序列中的一种。[0052]一种检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针，与野生型未突变的EGFR外显子19的DNA互补，含有以下核苷酸序列之一(SEQ ID N0.16~20):
[0053]PNA1:5，-GAATTAAGAGAAGCA-3 ’，
[0054]PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，，
[0055]PNA3:5，-TAAGAGAAGCAACAT-3，，
[0056]PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，，
[0057]PNA5:5，-AGAAGCAACATCTCC-3，。
[0058]优选的，这种检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针核苷酸是SEQ ID N0.16~20序列中的一种。
[0059]上述的标记TaqMan探针、PNA探针和PCR扩增引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子19缺失突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
[0060]一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，含有以下物质中的至少一种:
[0061](I)上述的PCR扩增引物，
[0062](2)上述的 TaqMan 探针，
[0063](3 )上述的PNA探针。
[0064]上述试剂盒中还包括正向和反向的质控PCR引物和质控TaqMan探针；
[0065]所述的质控PCR弓丨物用于扩增含EGFR基因DNA模板上保守序列(优选为EGFR外显子2);质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合。
[0066]优选的，所述正向和反向的质控PCR弓丨物及质控TaqMan探针的核苷酸部分选自以下各组序列中的一组:
[0067](I)正向引物:CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC (SEQ ID N0.21)，
[0068]反向引物:CRl:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA(SEQ ID N0.23)，
[0069]质控TaqMan 探针的核苷酸部分:CP1:TCACGCAGTTGGGCAC (SEQ ID N0.25);或者，
[0070](2)正向引物:CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC (SEQ ID N0.22)，
[0071]反向引物:CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT(SEQ ID N0.24)，
[0072]质控TaqMan 探针的核苷酸部分:CP2:ACGCAGTTGGGCACTT (SEQ ID N0.26)。
[0073]这种试剂盒可以基于数字PCR平台检测位于EGFR外显子19上c.2230-c.2260范围内的若干个碱基(通常为15~19个碱基)的缺失突变。
[0074]本发明检测EGFR外显子19缺失突变的方法，步骤包括:
[0075]1.将待测的DNA模板、正向和反向的PCR扩增引物、标记TaqMan探针、PNA探针、正向和反向的质控PCR引物、质控TaqMan探针与PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
[0076]正向和反向的PCR扩增引物可用于扩增含有EGFR外显子19上c.2230-c.2260序列的片段；
[0077]正向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.1~5)之一:
[0078]Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
[0079]F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，[0080]F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
[0081 ]F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0082]F5:5， -AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，；
[0083]反向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列之一(SEQ ID N0.6~10):
[0084]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
[0085]R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
[0086]R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
[0087]R4:5，-CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
[0088]R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3，；
[0089]优选的，正向PCR扩增引物为SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列；反向PCR扩增引物为SEQ ID N0.6~10之一的核苷酸序列；
[0090]更优选的，正向和反向PCR扩增引物选自以下各组序列之一:
[0091](I)正向:F1:5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
[0092]反向Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3 ’，或者，
[0093](2 )正向:F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’，
[0094]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’，或者，
[0095](3 )正向:F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’，
[0096]反向R3:5 ’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，或者，
[0097](4 )正向:F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0098]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’，或者，
[0099](5 )正向:F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，，
[0100]反向R5:5 ’ -CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
[0101]标记TaqMan探针能够与缺失位点下游的DNA模板结合，为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其中核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种(SEQ IDN0.11~15):
[0102]P1:5 ’ -ACTCACATCGAGGATTTCC-3，，
[0103]P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
[0104]P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
[0105]P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
[0106]P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0107]优选的，TaqMan探针上的核苷酸部分为SEQ ID N0.11~15核苷酸序列中的一种。TaqMan探针上的荧光基团选自6_羧基荧光素(FAM)、六氯_6_羧基荧光素(HEX)、Cy5、Cy3、VIC,荧光猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明(TAMARA)、BHQU BHQ2或MGB。
[0108]PNA探针与野生型未突变的EGFR外显子19的DNA互补，含有以下核苷酸序列之一(SEQ IDN0.16 ~20):
[0109]PNAl: 5，-GAATTAAGAGAAGCA-3 ’
[0110]PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，
[0111]PNA3:5，-TAAGAGAAGCAACAT-3，
[0112]PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，
[0113]PNA5:5，-AGAAGCAACATCTCC-3，。[0114]优选的，PNA探针为SEQ ID.N0.16~20之一的核苷酸。
[0115]所述的正向和反向质控PCR引物用于扩增含EGFR外显子19的DNA模板上保守序列(优选为EGFR外显子2);质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的突光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列
结合?
[0116]所述的质控PCR引物用于扩增EGFR外显子19所在DNA模板上的保守序列，优选为，扩增EGFR外显子2 ;
[0117]所述的质控PCR引物及质控TaqM an探针的核苷酸部分选自以下各组序列中的一组:
[0118](I)正向引物:CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC (SEQ ID N0.21)，
[0119]反向引物:CRl:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA(SEQ ID N0.23)，
[0120]质控TaqMan 探针的核苷酸部分:CP1:TCACGCAGTTGGGCAC (SEQ IDN0.25);或者，
[0121](2)正向引物:CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC (SEQ ID N0.22)，
[0122]反向引物:CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT(SEQ ID N0.24)，
[0123]质控TaqMan 探针的核苷酸部分:CP2:ACGCAGTTGGGCACTT (SEQ ID N0.26)。
[0124]上述引物和探针是针对EGFR外显子19缺失设计优化的，尤其是针对数字PCR平台的检测。在数字PCR混合液中，待测样品的DNA模板含量为0.25~Ing/ μ L (优选为
0.4~0.6ng/ μ L)，正向和反向PCR扩增引物含量分别为500~700nM，标记TaqMan探针以及PNA探针含量分别为200~400nM ;正向和反向质控PCR引物含量分别为500~700nM，质控TaqMan探针含量为200~400nM。
[0125]更优选的，数字PCR混合液中，待测样品的DNA模板的含量为0.5ng/l.! L，正向和反向PCR引物含量分别为600nM，标记TaqMan探针以及PNA探针含量分别为300nM，正向和反向质控PCR引物含量分别为600nM，质控TaqMan探针含量为300nM。
[0126]2.数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应，条件为:93~97°C预变性3~15分钟；93~97°C变性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共进行20~60个循环，2~10°C终止反应；
[0127]优选的PCR扩增条件为:93.5~95°C预变性3~6分钟；93.5~95°C变性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共进行30~35个循环，6~10°C终止反应。
[0128]更优选的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟；94°C变性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共进行32个循环，10°C终止反应。
[0129]优选的，数字PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000~20000个微反应液滴。
[0130]3.收集信号并进行结果判断:对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有EGFR外显子19缺失突变的DNA模板，还可确定其中EGFR基因外显子19缺失突变的DNA模板数量和含量。
[0131]可用QuantaSoft (Biorad)软件进行数据分析,计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。
[0132]由于质控PCR引物的作用，PCR微反应液滴中只要含有样品DNA模板，不论是否发生缺失突变，都会发生扩增反应，并且结合了质控TaqMan探针，因此会有荧光信号。发生了缺失突变的DNA模板,加入PCR引物扩增后,还结合了标记TaqMan探针。质控与标记TaqMan探针的荧光基团类型不同，因此根据不同的荧光信号可以分辨出样品中是否含有EGFR基因外显子19缺失突变的DNA模板。再根据发生了突变的荧光信号数量以及总的荧光信号数量，可确定EGFR基因外显子19缺失突变的DNA模板含量，进行定量分析。
[0133]通过上述方法，可以检测位于EGFR外显子19上c.2230-c.2260范围内的10~19个碱基的缺失突变。
[0134]与现有技术比较，本发明的优点在于:
[0135]1.结果判读方式:以前的技术方法结果的判读需要人工参与，肉眼依据相关图形作出最后的判断，这种判读的方式严重依赖经验，速度慢且很容易产生假阳性和假阴性的判读结果。我们的技术方式给出的是数据信息，可以借助软件完全自动化的进行结果判读，从而加快了数据分析的速度，也减少了产生假阴性和假阳性判读的可能。
[0136]2.结果描述的方式:以前的技术方式对基因变异的描述是定性的方式，也就是说，只是描述某个特异的基因变异是否存在于检测样本。本技术方法对基因变异的描述是绝对定量的方式，可以给出样本所携带某种特异基因变异DNA的绝对数量和比例。而且准确率高，即使在突变样本含量较低的情况下，定量分析的误差也很小。[0137]3.检测灵敏度(数值越小灵敏度越好):以前技术方法的灵敏度一般在1%— 50%之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，为1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。
【专利附图】
【附图说明】
[0138]图1为实施例1中，不同含量突变样本的荧光检测结果。
【具体实施方式】
[0139]实施例1
[0140](I)准备待测DNA样品:含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子19缺失的突变阳性DNA以及野生型与突变DNA混合样本(其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/2500)。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。突变DNA来源于携带EGFR19突变的阳性细胞系。其中EGFR19外显子上c.2238 —
c.2255位的片段缺失突变。
[0141](2)室温融解用于检测EGFR外显子19缺失的PCR扩增引物及对应的标记TaqMan探针和PNA探针，融解用于扩增EGFR外显子2的正向和反向质控PCR引物及质控TaqMan探针。
[0142]正向和反向PCR扩增引物的序列为:
[0143]Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，
[0144]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，
[0145]标记TaqMan探针的序列包括荧光基团、核苷酸部分及猝灭基团，荧光基团和猝灭基团分别为FAM和MGB，核苷酸部分如SEQ ID N0.11所示，标记TaqMan探针为:P1:FAM -ACTCACATCGAGGATTTCC-MGB。[0146]PNA 的序列如 SEQ ID N0.16 所示，PNAl: 5’ -GAATTAAGAGAAGCA-3’。
[0147]正向和反向质控PCR引物的序列为:
[0148]CF2:5，-GCCAAGGCACGAGTAACAAGC-3 ’
[0149]CR2:5，-CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT-3’
[0150] 质控TaqMan探针的荧光基团和猝灭基团分别为VIC和MGB，核苷酸部分如SEQ IDN0.26所示,质控TaqMan探针为:
[0151]CP2:VIC-ACGCAGTTGGGCACTT - MGB。
[0152](3)按照以下配比制备PCR反应液:2X数字PCR预混液(Biorad，#186-3022)与PCR扩增引物和质控PCR引物(600nM)、标记和质控TaqMan探针(300nM)以及PNA探针(300nM)与待检测DNA (IOng)配制成数字PCR混合液，用双蒸水补足至终体积为20 μ L。配制的数字PCR混合液中，正向和反向PCR扩增引物含量分别为600ηΜ、标记TaqMan探针含量为300ηΜ，ΡΝΑ探针含量300ηΜ ;正向和反向质控PCR引物含量分别为600ηΜ，质控TaqMan探针含量为300ηΜ。
[0153](4)配制好的20μ L数字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板内，然后加入60μ L液滴制作油到制作板，再放入QX200微滴发生器中，用于制备PCR微反应液滴。
[0154](5)将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000~20000个。
[0155](6)将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应:
[0156]94°C预变性5分钟；94°C变性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共进行32个循环，10°C终止反应。
[0157](7)PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪(QX200微滴荧光信号收集系统)中进行信号收集，结果如图1。用QuantaSoft (Biorad)软件进行数据分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对野生型DNA的比例。
[0158]通过上述步骤检测，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变。
[0159]含有突变型DNA模板的微反应液滴中，同时出现FAM和VIC荧光信号，记为一个信号数；含未发生突变的野生型DNA模板的微反应液滴中，仅出现VIC荧光信号。
[0160]定量检测结果，突变型DNA模板含量不同的样本中，突变阳性信号数(即FAM信号数)与总信号数即总微反应液滴的数量比例如下:
[0161]1/1样品 6477/13028计算值突变/野生=0.989/1，误差1.2%
[0162]1/100样品186/18700 计算值突变/野生=0.01/1，误差0.2%
[0163]1/1000 样品 23/19854 计算值突变 / 野生=0.00116/1，误差 16%
[0164]1/2500 样品 11/19928 计算值突变 / 野生=0.00055/1，误差 37%
[0165]突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1~1/100时，定量检测误差低于2%。
[0166]选用以下各组之一的正向和反向PCR扩增引物时，按上述步骤检测，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变，且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1~1/100时，定量检测误差低于2%:
[0167](I)正向 F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’
[0168]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’
[0169](2 )正向 F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’[0170]反向R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3 ’
[0171](3 )正向 F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3 ’
[0172]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’
[0173](4 )正向 F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，
[0174]反向R5:5 ’ -CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
[0175]改用以下序列之一的PNA探针时(SEQ ID N0.17~20)，按上述步骤检测，效果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变:
[0176](I) PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，
[0177](2) PNA3:5，-TAAGAGAAGCAACAT-3，
[0178](3) PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，
[0179](4) PNA5:5，-AGAAGCAACATCTCC-3，。
[0180]当所使用的标记TaqMan探针的核苷酸部分改用以下序列之一(SEQ ID N0.12~16)时，效果相同。在 突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变:
[0181](I)P2:5，-TCACATCGAGGATTTCCTT-3，
[0182](2 ) P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，
[0183](3) P4:5，-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，
[0184](4) P5:5，-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0185]通过上述方法，可以检测EGFR19外显子上c.2238 — c.2255位缺失突变，检出限达到 1/2500。
[0186]将突变型的DNA样品换为在EGFR19外显子上c2238 — c.2250位片段缺失突变的DNA,用上述方法检测，检出限也可达到1/2500，且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1~1/100时，定量误差低于5%。
[0187]正向和反向的质控PCR引物，以及质控TaqMan探针可改用以下序列，效果相同。
[0188]正向质控PCR 引物 CFl: 5 ’ -GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC-3 ’
[0189]反向质控PCR 引物 CRl: 5 ’ -TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA-3 ’
[0190]质控TaqMan 探针 CP1VIC-TCACGCAGTTGGGCAC-MGB。
[0191]对照例
[0192]一、使用不同PCR引物、PNA探针或者TaqMan探针
[0193]1、按照实施例1的方法，区别在于使用的PCR扩增引物不同，是按照荧光定量PCR技术设计的正反向引物。
[0194]正向和反向PCR扩增引物的序列分别为:
[0195]F1，:5， -GGGACTCTGGATCCCAGAAGGTG-3’
[0196]R1，:5， -CTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’
[0197]在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约一半样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
[0198]2、按照实施例1的方法，区别于在按荧光定量PCR技术设计的标记TaqMan探针的核苷酸序列为:P1’:5’ -AAAGCAGAAACTCACATCG-3’。
[0199]标记TaqMan探针上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB。
[0200]在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约一半样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
[0201]3、按照实施例1的方法，区别在于使用的PNA的序列为:PNAI’:5’ -AGCAACATCTCCGA-3，。
[0202]定性检测:在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约一半样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
[0203]突变样本含量为1/100的样品进行定量检测，误差为15%以上。
[0204]二、使用不同浓度的PCR扩增引物、探针
[0205]1、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中的正向和反向PCR扩增引物分别为ΙΟΟηΜ。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。
[0206]2、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中的正向和反向PCR扩增引物含量分别为ΙΟΟηΜ，标记TaqMan探针和PNA探针含量分别为ΙΟΟηΜ。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。
[0207]3、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中的正向和反向PCR扩增引物、正向和反向质控PCR引物标记TaqMan探针、质控TaqMan探针和PNA探针含量分别为1000nM。此时野生DNA样品出现假阳性信号，检测体系已无法给出准确结果。
[0208]三、使用荧光定量 PCR的方法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。
【权利要求】
1.一种检测EGFR外显子19缺失突变的P CR扩增引物，其特征在于，为反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物； 正向引物含有以下核苷酸序列中的一种:
Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
F2:5 ’ -GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，
F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3，，
F4:5 ’ -GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，， F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，； 反向引物含有以下核苷酸序列中的一种；
Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
R2:5 ’ -GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
2.权利要求1所述检测EGFR外显子19缺失突变的PCR扩增引物，其特征在于，正向PCR扩增引物选自以下核苷酸序列中的一种:
Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
F2:5 ’ -GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，
F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3，，
F4:5 ’ -GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，， F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，； 反向PCR扩增引物选自以下核苷酸序列中的一种:
Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
3.权利要求1所述检测EGFR外显子19缺失突变的PCR引物，其特征在于，PCR扩增引物选自以下各组引物中的一组: (1)正向:Fl:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’， 反向 Rl: 5 ’ -ATGGACCCCCACACAGCA-3，，或者， (2)正向:F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’ 反向 R2:5’ -GGACCCCCACACAGCAAA-3’，或者， (3)正向:F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’， 反向 R3:5’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，或者， (4)正向:F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’， 反向 R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，或者， (5)正向:F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，， 反向 R5:5’ -CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
4.一种检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，其特征在于，所述标记TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其中核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种:
Pl: 5，-ACTCACATCGAGGATTTCC-3，，
P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
P3:5 ’ -ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
5.权利要求4所述检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，其特征在于，所述标记TaqMan探针的荧光基团选自6_羧基荧光素、六氯_6_羧基荧光素、Cy5、Cy3或VIC，猝灭基团选自6-羧基四 甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
6.权利要求4所述检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，所述核苷酸部分选自以下核苷酸序列中的一种:
Pl: 5，-ACTCACATCGAGGATTTCC-3，，
P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
P3:5 ’ -ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
7.—种检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针，其特征在于，含有以下核苷酸序列之
PNAl:5，-GAATTAAGAGAAGCA-3，，
PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，，
PNA3:5， -TAAGAGAAGCAACAT-3，，
PNA4:5， -AGAGAAGCAACATCT-3，，
PNA5:5， -AGAAGCAACATCTCC-3，。
8.权利要求7所述检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针，其特征在于，选自以下核苷酸序列之一:
PNAl:5，-GAATTAAGAGAAGCA-3，，
PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，，
PNA3:5， -TAAGAGAAGCAACAT-3，，
PNA4:5， -AGAGAAGCAACATCT-3，，
PNA5:5， -AGAAGCAACATCTCC-3，。
9.一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质中的至少一种: (1)权利要求1、2或3所述的PCR扩增引物； (2)权利要求4或5所述的标记TaqMan探针； (3)权利要求6、7或8所述PNA探针。
10.权利要求9所述检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，还包含正向和反向的质控PCR引物和质控TaqMan探针；所述的质控PCR引物用于扩增含EGFR基因DNA模板上保守序列；质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合。
11.权利要求10所述检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述的质控PCR引物用于扩增EGFR外显子2。
12.权利要求10或11所述检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述的质控PCR引物及质控TaqMan探针的核苷酸部分选自以下各组序列中的一组: (I)正向引物:CFl:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC, 反向引物:CRl: TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA, 质控TaqMan探针的核苷酸部分:CP1: TCACGCAGTTGGGCAC ;或者， (2 )正向引物:CF2: GCCAAGGCACGAGTAACAAGC， 反向引物:CR2: CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT， 质控TaqMan探针的核苷酸部分:CP2: ACGCAGTTGGGCACTT。
13.一种检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制备数字PCR混合液:将待检测样品、权利要求1~3任一项所述的PCR扩增引物、权利要求4或5所述标记TaqMan探针、权利要求6或7所述PNA探针、正向和反向质控PCR引物和质控TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液； 所述的质控PCR引物用于扩增含EGFR基因的DNA模板上保守序列；质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合； (2)数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应； PCR扩增条件为:93~97°C预变性3~15分钟；93~97°C变性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共进行20~60个循环，2~10°C终止反应； (3)收集信号并进行结果判断:对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有EGFR外显子19缺失突变的DNA模板及其数量和含量。
14.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，在数字PCR混合液中，DNA模板的含量为0.25~Ing/μ L，正向和反向PCR扩增引物含量分别为500~700ηΜ，标记TaqMan探针和PNA探针含量分别为200~400ηΜ ;正向和反向质控PCR引物含量分别为500~700ηΜ，质控TaqMan探针含量分别为200~400ηΜ。
15.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，在数字PCR混合液中，待测样品的DNA模板含量为0.5ng/ μ L，正向和反向PCR扩增弓丨物含量分别为600ηΜ，标记TaqMan探针以及PNA探针含量分别为300ηΜ，正向和反向质控PCR引物含量分别为600ηΜ，质控TaqMan探针含量分别300ηΜ。
16.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为:93.5~95°C预变性3~6分钟；93.5~95°C变性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共进行30-35个循环，6~10°C终止反应。
17.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟；94°C变性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共进行32个循环，10°C终止反应。
【文档编号】C12N15/11GK103923975SQ201410041188
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】王世亨 申请人:上海涌泰生物医药科技有限公司