基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法

基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法，涉及microRNA。试剂盒设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶。在200μL血浆充分裂解后加入所述试剂盒中提供的工作浓度为5n?mol的血浆miRNA外源性参照，立即进行漩涡震荡15s，其余步骤同常规方法；应用所述试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA；应用所述试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行分析。其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量。
【专利说明】基于AIIG10探针荧光定量PCR的血浆m i croRNA检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及microRNA，具体涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程，通过调苄基因表达，在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用。具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pr1-miRNA到pre_miRNA,后转运出细胞核,通过剪切形成成熟miRNA,通过与Ago蛋白等形成RISC (RNA诱导的沉默复合体)，部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297.)。
[0003]由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义，目前检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足之处在于不能准确检测到低表达的miRNA ;微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时、费力、标记成本高、检测灵敏度与特异性低等问题。
[0004]实时荧光定量技术(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括RNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种:同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针(一种适合于扩增短片段的荧光探针)。由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA的缺点在于合成价格贵,不利于推广。
[0005]目前AllGl0探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵袭性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。
【发明内容】

[0006]针对现有检测血浆miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，本发明的第一个目的在于提供检测三种血浆miRNA的特异引物。
[0007]本发明的第二个目在于提供基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒。
[0008]本发明的第三个目的在于提供一种基于AllGl0探针荧光定量PCR的三种血浆miRNA检测方法。
[0009]所述三种血衆miRNA 分别是指 hsa-miR-504、hsa_miR-133b、cel-miR-39 ;其中hsa-miR-504 与 hsa_miR-133b 为人源性 miRNA, cel-miR-39 为线虫来源的 miRNA,作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程。
[0010]所述检测三种血浆miRNA的特异引物包括三种血浆miRNA特异性逆转录引物和三种血浆miRNA特异性正向引物；
[0011]所述三种血衆miRNA特异性逆转录引物由hsa-miR-504的特异性逆转录引物、hsa-miR-133b的特异性逆转录引物和cel-miR-39的特异性逆转录引物组成；
[0012]所述hsa-miR-504的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.1 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3 ;；
[0013]所述hsa-miR-133b的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.2 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3 ;；
`[0014]所述cel-miR-39的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.3 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3 ;。
[0015]所述三种血衆miRNA特异性正向引物由hsa-miR-504的特异性正向引物、hsa-miR-133b的特异性正向引物和cel-miR-39的特异性正向引物组成；
[0016]所述hsa-miR-504的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.45 ; -GCTGGTTAAGACCCTGGT-3 ;；
[0017]所述hsa-miR_133b的特异性正向引物核苷酸序列为SEQ ID N0.55 ; -TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3 ;；
[0018]所述cel-miR-39的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.65 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;。
[0019]所述三种血浆miRNA特异性AllGlo探针由hsa-miR-504的特异性AllGlo探针、hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针和cel-miR-39的特异性AllGlo探针组成；
[0020]所述hsa-miR-504的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.7MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR ；
[0021]所述hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.8JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP ；
[0022]所述cel-miR-39的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.9NEP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-NEP。
[0023]所述三种血浆miRNA的通用引物序列的核苷酸序列为SEQ IDN0.105 ' -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 '。
[0024]所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，miRNA提取试剂瓶内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0025]所述miRNA提取试剂包括血衆miRNA外源性参照,所述血衆miRNA外源性参照是指人工合成的cel-miR-39的模拟物(人工合成的cel-miR-39的模拟物作为一种外源性加入的参照，其工作浓度为5n mol，作用在于能够监测从提取microRNA到后面实时荧光定量PCR全过程的反应效率)。
[0026]所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT 缓冲液(5XRT 缓冲液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50mmoIDTT组成)、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl2、I μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为lOOnmol)。
[0027]所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10 X Taq缓冲液(10 X Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl,500m mol KCDUOm mol 的 MgCl2、5 单位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针。
[0028]所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测方法，包括以下步骤: [0029]1.在200 μ L血浆充分裂解后加入所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒中提供的工作浓度为5n mol的血浆miRNA外源性参照，立即进行漩涡震荡15s，其余步骤同常规方法；
[0030]2.应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA ；
[0031]3.应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；
[0032]4.综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline),进行结果分析。
[0033]所述AllGlo 探针可米用美国 AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探针，它拥有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，去掉了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman —端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火温度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
[0034]所述AllGl0探针具有以下优势:①提高Tm值(可达10°C以上)，探针更短可以达到15~16个碱基，可以适用A，T含量比较高的序列设计探针；②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。[0035]本发明采用了 AllGl0探针技术，设计了三种特异正向引物和特异探针和通用反向引物，三种探针两端只需分别标记三种特殊荧光基团(MAR、JUP,NEP),能够同时检测三种miRNA,并对该技术反应条件进行优化，建立了一种基于AllGl0探针技术联合实时荧光定量PCR技术同时检测三种血浆miRNA的方法，应用前景广阔。
[0036]本发明采用了 AllGl0探针技术，建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法，与Taqman-MGB探针法相比，线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定量PCR灵敏度最低可达10拷贝/yL，最高可达IO7拷贝/yL。
[0037]本发明的有益效果如下:
[0038]本发明提供了一种检测miRNA基于AllGlo探针RT-qPCR的检测方法和试剂盒，其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量，与现有技术相比具有以下优势: [0039]1.与northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高，价格比microRNA芯片要便宜；
[0040]2.与taqman-MGB探针相比，AllGl0探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当于taqman-MGB的一半。
[0041]3.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测miRNA方法，适合于做为芯片筛选miRNA的的后期临床样本验证，以及研究miRNA在不同领域的差异性表达等，推动了miRNA在相关疾病的深入研究。
【专利附图】

【附图说明】
[0042]图1为本发明实施例基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒的结构组成示意图。
[0043]图2为AllGlo探针实时荧光定量PCR检测三种标准品混合液中hsa_miR-133b(人源性miR-133b)的扩增曲线图。
[0044]图3为AllGlo探针实时荧光定量PCR检测三种标准品混合液中hsa_miR-133b(人源性miR-133b)的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0045]实施例1
[0046]参见图1，本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒实施例设有盒体1、隔板2、miRNA提取试剂瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5 ;隔板2设在盒体I内，miRNA提取试剂瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5插在隔板2上，miRNA提取试剂瓶3内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶4内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶5内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0047]所述miRNA提取试剂包括血衆miRNA外源性参照,所述血衆miRNA外源性参照是指人工合成的cel-miR-39的模拟物(人工合成的cel-miR-39的模拟物做为一种外源性加入的参照，其工作浓度为5n mol，作用在于能够监测从提取microRNA到后面实时荧光定量PCR全过程的反应效率)。
[0048]所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT 缓冲液(5XRT 缓冲液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50mmoIDTT组成)、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgCl2、I μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为lOOnmol)。
[0049]所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10XTaq缓冲液(10 X Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl,500m mol KCDUOm mol 的 MgCl2、5 单位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针。
[0050]实施例2
[0051]本发明的具体操作步骤及反应体系如下:
[0052]1.提取 miRNA
[0053]采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒，按照操作说明书进行样本(血浆)microRNA提取，其中200 μ L血浆在加入等体积裂解液静置5min后加入外源性参照cel_mir395 μ L (工作浓度为5n mol),后按照说明书操作进行,最后用30 μ L的去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，取2~20ng的已提取的miRNA用于下游的逆转录，其余的miRNA均于_80°C冻存。
[0054]2.miRNA 的逆转录:
[0055]2.1将逆转录所需成分于室温下溶解，震荡混匀后置于冰上；
[0056]2.2配制逆转录反应混合液，按表1进行配制:
[0057]表1`
[0058]
【权利要求】
1.检测三种血浆mi RNA的特异引物，其特征在于所述三种血浆m i RNA分别是指hsa-miR-504、hsa_miR-133b、cel-miR-39 ;其中 hsa-miR-504 与 hsa_miR-133b 为人源性miRNA, cel-miR-39为线虫来源的miRNA，作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程； 所述检测三种血浆miRNA的特异引物包括三种血浆miRNA特异性逆转录引物和三种血浆miRNA特异性正向引物； 所述三种血衆miRNA特异性逆转录引物由hsa-miR-504的特异性逆转录引物、hsa-miR-133b的特异性逆转录引物和cel-miR-39的特异性逆转录引物组成； 所述hsa-miR-504的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.1 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3 ;； 所述hsa-miR-133b的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.2 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3 ;； 所述cel-miR-39的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.3 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3 ;； 所述三种血浆miRNA特异性正向引物由hsa-miR-504的特异性正向引物、hsa-miR-133b的特异性正向引物和cel-miR-39的特异性正向引物组成； 所述hsa-miR-504的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.45 ; -GCTGGTTAAGACCCTGGT-3 ;； 所述hsa-miR-1 33b的特异性正向引物核苷酸序列为SEQ ID N0.55 ; -TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3 ;； 所述cel-miR-39的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.65 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;。
2.三种血浆miRNA特异性AllGlo探针，其特征在于所述三种血浆miRNA分别是指hsa-miR-504、hsa_miR-133b、cel-miR-39 ;其中 hsa-miR-504 与 hsa_miR-133b 为人源性miRNA, cel-miR-39为线虫来源的miRNA，作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程； 所述三种血浆miRNA特异性AllGlo探针由hsa-miR-504的特异性AllGlo探针、hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针和cel-miR-39的特异性AllGlo探针组成； 所述hsa-miR-504的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.7MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR ； 所述hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.8JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP ； 所述cel-miR-39的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.9NEP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-NEP ； 所述三种血浆miRNA的通用引物序列的核苷酸序列为SEQ ID N0.105 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
3.基于AlIGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，miRNA提取试剂瓶内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
4.如权利要求3所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒，其特征在于所述miRNA提取试剂包括血衆miRNA外源性参照,所述血衆miRNA外源性参照是指人工合成的cel-miR-39的模拟物，人工合成的cel-miR-39的模拟物作为一种外源性加入的参照，其工作浓度为5n mol，作用在于能够监测从提取microRNA到后面实时荧光定量PCR全过程的反应效率。
5.如权利要求3所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒，其特征在于所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、1Om mol dNTP混合液、5 X RT缓冲液、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、1Om mol的MgCl2U μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为IOOn mol ;所述5XRT缓冲液由250m molTris-HCl，375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m mol DTT 组成。
6.如权利要求3所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10XTaq缓冲液、10m mol的MgCl2、5单位/ μ L的Taq聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针；所述10XTaq缓冲液包括100m molTris-HCl, 500mmol KC1。
7.基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)在200μ L血浆充分裂解后加入所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒中提供的工作浓度为5n mol的血浆miRNA外源性参照，立即进行漩涡震荡15s，其余步骤同常规方法； 2)应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA ； 3)应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增； 4)综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。
8.如权利要求7所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测方法，其特征在于所述AllGlo探针采用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探针。
【文档编号】C12N15/11GK103773878SQ201410041147
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】张忠英, 唐晶 申请人:厦门大学附属中山医院