基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒及其检测方法，涉及microRNA。试剂盒设有盒体、隔板、茎环逆转录试剂瓶和实时荧光定量PCR试剂瓶。按照常规方法提取组织中microRNA；应用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA；应用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。
【专利说明】基于Al IG1探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及miCToRNA，尤其是涉及一种基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程，通过调苄基因表达，在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用。具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pr1-miRNA到pre_miRNA,后转运出细胞核,通过剪切形成成熟miRNA,通过与Ago蛋白等形成RISC (RNA诱导的沉默复合体)，部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297)。
[0003]由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义，目前检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足之处在于不能准确检测到低表达的miRNA ;微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时、费力、标记成本高、检测灵敏度与特异性低等问题。
[0004]实时荧光定量技术(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目`前用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括RNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种:同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针(一种适合于扩增短片段的荧光探针)。由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA的缺点在于合成价格贵,不利于推广。
[0005]目前AllGl0探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵袭性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。
【发明内容】
[0006]针对现有检测组织miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，本发明的第一个目的在于提供检测二种组织miRNA的特异引物。
[0007]本发明的第二个目在于提供基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒。
[0008]本发明的第三个目的在于提供一种基于AllGl0探针荧光定量PCR的二种组织miRNA检测方法。
[0009]所述二种组织miRNA分别是指hsa-miR-504和hsa_miR-133b,两者均为人源性miRNA。
[0010]所述检测组织miRNA的特异引物包括组织miRNA的特异性逆转录引物和组织miRNA的特异性正向引物。
[0011]所述组织miRNA的特异性逆转录引物由hsa-miR-504的特异性逆转录引物和hsa-miR-133b的特异性逆转录引物组成。
[0012]所述hsa-miR-504的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.15 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3 ;；
[0013]所述hsa-miR-133b的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.25 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3 ;；
[0014]所述组织miRNA的特异性正向引物由hsa-miR-504的特异性正向引物和hsa-miR-133b的特异性正向引物组成`:
[0015]所述hsa-miR-504的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ IDN0.35 ; -GCTGGTTAAGACCCTGGT-3 ;；
[0016]所述hsa-miR-133b的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ IDN0.45 ; -TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3 ;。
[0017]组织miRNA的特异性AlIGlo探针由hsaiiR-504的特异性AlIGlo探针和hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针组成。
[0018]所述hsa-miR-504的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.5MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR ；
[0019]所述hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.6JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP。
[0020]所述二种组织miRNA的通用反向引物序列的核苷酸序列为SEQ IDN0.75 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
[0021]所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒设有盒体、隔板、茎环逆转录试剂瓶和实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，茎环环逆转录试剂瓶和实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，茎环环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0022]所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT 缓冲液(5XRT 缓冲液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50mmol DTT组成)、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgCl2U μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为IOOn mol)。
[0023]所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10XTaq缓冲液(IOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl, 500m mol KCl )、IOm mol 的 MgCl2、5 单位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针。
[0024]所述基于AllGlo探针突光定量PCR的组织microRNA检测方法,包括以下步骤:
[0025]I)按照常规方法提取组织中microRNA ；
[0026]2)应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA ；
[0027]3)应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；
[0028]4)综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline),进行结果分析。
[0029]所述AllGlo 探针可米用美国 AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探针，它拥有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，去掉了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman —端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火温度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
[0030]所述AllGl0探针具有以下优势:①提高Tm值(可达10°C以上)，探针更短可以达到15~16个碱基，可以适用A，T含量比较高的序列设计探针；②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0031]本发明采用了 AllGl0探针技术，设计了特异的正向引物和通用的反向引物及探针，探针两端只需标记一种特殊荧光基团MAR,能够达到同时检测多种miRNA的能力，大大节省成本，并对该技术反应条件进行优化，建立了一种基于AllGlo探针技术联合实时荧光定量PCR技术同时检测多种miRNA的方法，应用前景广阔。
[0032]本发明采用了 AllGl0探针技术，建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法，与taqman-MGB探针法相比，线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定量PCR灵敏度最低可达10拷贝/yL，最高可达IO7拷贝/yL。
[0033]本发明提供一种基于AllGlo探针检测microRNA的方法及相关的试剂盒的组成，通过设计microRNA的引物和探针，来达到精确定量检测目的，相较目前的检测手段，其优势在于:①AllGlo探针合成成本和难度较Taqman-MGB低，利于推广AllGlo探针本身具有两个相同的荧光基团，既互为报告基团，又互为淬灭基团，产生的荧光信号比其他探针更强，灵敏更高；③探针本身设计的几种基团之间不存在相互的荧光干扰，适合进行多重PCR反应；④探针浓度的增高并不会抑制荧光定量PCR逾同时检测多种miciORNA，相较目前普遍的单管单个microRNA的荧光定量PCR检测更能节省样本。[0034]本发明的有益效果如下:
[0035]本发明提供了一种检测miRNA基于AllGlo探针RT-qPCR的检测方法和试剂盒，其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量，与现有技术相比具有以下优势:
[0036]1.与northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高，价格比microRNA芯片要便宜；
[0037]2.与taqman-MGB探针相比，AllGl0探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当于taqman-MGB的一半。
[0038]3.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测miRNA方法，适合于做为芯片筛选miRNA的的后期临床样本验证，以及研究miRNA在不同领域的差异性表达等，推动了miRNA在相关疾病的深入研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒实施例的结构组成示意图。
【具体实施方式】
[0040]实施例1
[0041]参见图1，所述基于AlIGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒实施例设有盒体1、隔板2、茎环逆转录试剂瓶3和实时荧光定量PCR试剂瓶4 ;隔板2设在盒体I内，茎环环逆转录试剂瓶3和实时荧光定量PCR试剂瓶4插在隔板2上，茎环环逆转录试剂瓶3内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶4内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0042]①所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT缓冲液(5XRT缓冲液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl，15m mol MgCl2,50mmol DTT组成)、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgCl2U μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为IOOn mol)。
[0043]②所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10 X Taq缓冲液(10 X Taq缓冲液包括 IOOm mol Tris-HCl, 500m mol KCl)> 10m mol 的 MgCl2、5 单位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、IOOmL无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针。
[0044]实施例2
[0045]本发明的具体操作步骤及反应体系如下:
[0046]1.组织样品处理:将组织在液氮中磨碎。每30~50mg动物组织或者IOOmg植物组织加ImL裂解液MZ (天根生物公司生产)，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液MZ体积的10%。
[0047]2.提取 miRNA
[0048]采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒，按照操作说明书进行组织样本miRNA提取，最后用50 μ L的去核酶水洗脱溶解miRNA，于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度，取2~20ng的已提取的miRNA用于下游的逆转录，其余的miRNA均于-80°C冻存。
[0049]3.miRNA 的逆转录:
[0050]3.1将逆转录所需成分于室温下溶解，震荡混匀后置于冰上。
[0051]3.2配制逆转录反应混合液，按表1进行配制。
[0052]表1
[0053]
【权利要求】
1.检测二种组织miRNA的特异引物，其特征在于包括组织miRNA的特异性逆转录引物和组织miRNA的特异性正向引物，所述二种组织miRNA分别是指hsa-miR-504和hsa-miR-133b，两者均为人源性miRNA。
2.如权利要求1所述检测二种组织miRNA的特异引物，其特征在于所述组织miRNA的特异性逆转录引物由hsa-miR-504的特异性逆转录引物和hsa_miR-133b的特异性逆转录引物组成； 所述hsa-miR-504的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.15 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3 ;； 所述hsa-miR-133b的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.25 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3 ;。
3.如权利要求1所述检测二种组织miRNA的特异引物，其特征在于所述组织miRNA的特异性正向引物由hsa-miR-504的特异性正向引物和hsa-miR-133b的特异性正向引物组成； 所述hsa-miR-504的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ IDN0.35 ; -GCTGGTTAAGACCCTGGT-3 ;； 所述hsa-miR-133b的特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ IDN0.45 ; -TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3 ;。
4.组织miRNA的特异性AllGlo探针，其特征在于由hsa-miR-504的特异性AllGlo探针和hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针组成； 所述hsa-miR-504的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.5MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR ； 所述hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.6JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP ； 所述二种组织miRNA的通用反向引物序列的核苷酸序列为SEQ IDN0.75 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
5.基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、茎环逆转录试剂瓶和实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，茎环环逆转录试剂瓶和实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，茎环环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
6.如权利要求5所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒，其特征在于所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5 X RT缓冲液、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgCl2U μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为IOOn mol ;所述5XRT缓冲液由250m mol Tris-HCl,375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m mol DTT 组成。
7.如权利要求5所述基于AlIGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份=IOXTaq缓冲液、IOm mol的MgCl2、5单位/ P L的Taq聚合酶、IOmM dNTP混合液、100ml无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针；所述IOXTaq缓冲液包括IOOm mol Tris-HCl, 500m mol KC1。
8.基于AllGlo探针荧光定量PCR的组织microRNA检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)按照常规方法提取组织中HIiCT0RNA； 2)应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA ； 3)应用所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增； 4)综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline),进行结果分析。
9.如权利要求8所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的组织microRNA检测方法，其特征在于所述AllGlo探针采用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探针。`
【文档编号】C12Q1/68GK103773877SQ201410041141
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】唐晶, 张忠英 申请人:厦门大学附属中山医院