从d-氨基酸制备l-氨基酸的方法
【专利摘要】本发明涉及重组微生物，其与起始微生物相比具有更高浓度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、NADH共底物再生酶的一种，及如果需要还有过氧化氢酶，本发明还涉及一种通过使用这些微生物从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法。
【专利说明】从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法
[0001]本申请是2005年I月27日提交的题为“从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法”的中国专利申请200580005253.7的分案申请。
[0002]本发明涉及重组微生物，其与起始微生物相比具有更高浓度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、NADH共底物再生酶、并且如果需要还具有过氧化氢酶，本发明还涉及通过使用这些微生物从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法。
[0003]目前许多天然氨基酸是通过用遗传优化的细菌进行发酵而以对映异构体纯的形式而制备(de Graaf AA, Eggeling L, Sahm H2001.Metabolic Engineeringfor L-Lysine Production by Corynebacterium glutamicum.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73:9-29 ；Sahm H, Eggeling L, Eikmanns B,Kramer R.1996,Constructionof L-Lysine-,L-Threonine-, and L-1soleucin Overproducing Strains ofCorynebacterium Glutamicum.Ann N Y Acad Sci782:25-39)。
[0004]诚然,不是所有的蛋白质氨基酸(proteinogenic amino acids)并且仅极少数非天然氨基酸和D —氨基酸可以这种方式制备。由于对映异构体纯的氨基酸的化学合成非常昂贵，因此已经开发了一系列酶学方法，其中一些方法已经可以达到每年生产数吨的规模。
[0005]所述方法的范围包括从借助于酰基转移酶、酰胺酶、酯酶、海因酶(hydantoinase)、氨基酸氧化酶和蛋白酶的动态外消旋物裂解到利用裂合酶、氨基转移酶和脱氢酶的对映体选择性合成(Schmid A.et al.(2002) “The Use of Enzymes in theChemical Industry in Europe，，，Curr Opin Biotechnol13(4):359-366)。
[0006]除了对映体选择性合成法之外，动态外消旋物裂解(dynamisch kinetischeRacematspaltungen)也特别有效，其中不希望的对映异构体被原位外消旋化。在动态外消旋物裂解中，通过组合D-或L-氨基酸氧化酶与非选择性化学还原初始亚氨基酸为主要氨基酸，也可以达 到100%得率。然而，还原剂如NaBH4必须以至少25倍当量过量应用，这样导致这种方法非常昂贵(Enright et al., “Stereoinversion of Beta-andGamma-Substituted Alpha Amino Acids Using a Chemo-Enzymatic Oxidation-ReductionProcedure”，Chemical Communications (2003), (20), 2636-2637.)
[0007]本领域通常已知氨基酸脱氢酶对α -酮酸的氨基化。然而无可否认所得离析物与例如相应的外消旋氨基酸相比更加昂贵许多倍。
[0008]然而，通过联合氨基酸氧化酶与氨基酸脱氢酶，可以从氨基酸原位获得相应的酮酸。当这两种酶具有相反的对映体选择性时，D-氨基酸可以完全转变为L-氨基酸或者L 一氨基酸完全转变为D-氨基酸。从外消旋物开始，从中可以产生对映异构体纯的化合物。
[0009]在此NADH共底物必须使用酶再生，因为其太昂贵以至于不能以化学计量的量应用。从其底物中释放二氧化碳并因此使得反应不可逆的酶如甲酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶(脱羧化)是特别适用的(Hanson, R.L.et al.“Enzymatic Synthesis of L_6_Hydroxynorisoleucine，，, Bioorganic&Medicinal Chemistry (1999), 7 (10), 2247-2252,及 Nakajima N.et al., “Enzymatic Conversion of Racemic Methionine to theL-Enantiomer，，，Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1990),(
【权利要求】
1.大肠杆菌或芽孢杆菌重组微生物，其与起始生物体相比具有更高浓度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和NADH共底物再生酶。
2.权利要求1的微生物，其中所述NADH共底物再生酶是甲酸脱氢酶。
3.权利要求1的微生物，其中所述NADH共底物再生酶是苹果酸脱氢酶。
4.权利要求1的微生物，其中所述NADH共底物再生酶是醇脱氢酶。
5.权利要求1的微生物，其中所述L一氨基酸脱氢酶是L-亮氨酸脱氢酶。
6.权利要求1的微生物，其中所述D-氨基酸氧化酶是原玻璃蝇节杆菌或三角酵母的D-氨基酸氧化酶。
7.权利要求1的微生物，其中D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和NADH辅酶再生酶的胞内活性通过增加编码所述酶的核苷酸序列的拷贝数或者使用强启动子或者组合这两种措施而与起始微生物相比是增高的。
8.权利要求1的微生物，其中所述细胞是静态细胞。
9.通过使用对映体选择性酶合成途径从D-氨基酸生产L-氨基酸的方法，其特征在于将权利要求1-7任一项的重组微生物与含有D-氨基酸的溶液反应，并分离所得L-氨基酸。
10.权利要求9的方法，其特征在于应用权利要求8的微生物。
11.权利要求9或10 的方法，其特征在于选择苹果酸脱氢酶作为NADH共底物再生酶，并且将L-苹果酸盐或者L-苹果酸加入含有D-氨基酸的溶液。
12.权利要求9或10的方法，其特征在于使用微生物的静态细胞。
13.权利要求9或10的方法，其特征在于所用细胞的细胞壁通过化学或者物理措施而变得可通透并从溶液中吸收D-氨基酸。
14.权利要求9或10的方法，其特征在于应用选自如下一组的D-氨基酸或者外消旋DL-氨基酸:赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、组氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、头孢菌素。
15.权利要求9或10的方法,其中应用D-甲硫氨酸或DL-甲硫氨酸。
【文档编号】C12P13/12GK103834607SQ201410044828
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2005年1月27日 优先权日:2004年2月19日
【发明者】维尔纳·胡梅尔, 比吉特·戈伊克, 斯特芬·奥斯瓦尔德, 克里斯托夫·韦克贝克, 克劳斯·胡特马赫尔 申请人:赢创德固赛有限公司