一种鸭用免疫增强剂及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭用免疫增强剂及其制备方法。该免疫增强剂为鸭IL-8真核表达质粒的水溶液，其浓度为0.4mg/mL~0.8mg/mL，该真核表达质粒以pcDNA3.1作为真核表达载体，含有鸭IL-8全基因序列的重组载体。本发明提供的鸭白介素8真核表达质粒作为鸭病疫苗的免疫增强剂不仅安全有效，具有生物学活性，而且可诱导鸭对疫苗产生良好的体液免疫和细胞免疫应答，能够有效提高鸭禽流感抗体效价。
【专利说明】一种鸭用免疫增强剂及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着我国养鸭业迅猛发展，养鸭规模逐年扩大。据FAO统计，在2005年我国鸭存栏量就已超过7.25亿只，占世界总存栏量的72%左右，因此，养鸭业成为农民就业、脱贫、增收的重要产业，为我国经济的发展起着积极推动的作用，但也应看到，养鸭业在我国迅速壮大的同时，各种鸭病也接踵而至，据统计，禽流感、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒病、禽霍乱等疾病一直是鸭群非物理性死亡的主要原因。因此，我国养鸭业在各种鸭病的预防控制方面，面临着前所未有的挑战，也给西部地区蓬勃兴起的鸭群养殖业带来了严重的威胁。
[0003]目前，我国对鸭群疾病的控制主要以疫苗接种为主，且一般在疫苗中加入了弗氏佐剂、铝佐剂等免疫增强剂，但目前鸭业养殖中，许多鸭病疫苗对鸭群的免疫效果还是不尽人意，因此寻求新的鸭用高效免疫增强剂迫在眉睫。随着分子生物学技术的发展，细胞因子因其作用的特异性和高效性而被认为是当前最有研究前景的免疫增强剂。在众多细胞因子中，作为免疫增强剂已进行研究的有IL-1、IL-2、IL-4、IL-6等，并取得了积极的进展。
[0004]据研究资料显示，鸭IL-8是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子，对鸭群T淋巴细胞和B淋巴细胞有较强的趋化作用，该免疫增强剂的应用对提高鸭群免疫效果的控制上发挥重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是:提供一种基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂及其制备方法，该免疫增强剂能够促进鸭对疫苗产生良好的体液和细胞免疫应答，且不引起鸭产生不良反应，具有良好的生物安全性。
[0006]本发明的技术方案是:一种基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂，所述免疫增强剂为鸭IL-8真核表达质粒的水溶液，其浓度为0.4mg/mL^0.8mg/mL。
[0007]所述的鸭IL-8真核表达质粒含有鸭IL-8基因的编码序列，该基因的长度为312个核苷酸，类型为核苷酸，链性为单链，全长为编码区。
[0008]一种基于鸭IL-8基因真核表达质粒的免疫增强剂的制备方法，它包括以下步骤: 第一，提取鸭RNA;
第二，将获得的目的基因片段连接于PMD-18T载体，构建pMD-18T-1L-8，再转入大肠杆菌DH5 α中；
第三，采用PCR方法从pMD-18T-1L-8扩增出IL-8基因，用Xho I + BamH I进行酶切，同法处理真核表达载体PCDNA3.1，然后电泳分离和分别回收目的基因；
第四，采用Τ4 DNA连接酶将鸭IL-8基因插入真核表达质粒pcDNA3.1中，转化大肠杆菌DH5a，蓝白斑筛选，挑取可疑菌落于LB液体培养基于36°C~38°C培养12~18h，收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒，用PCR和双酶切鉴定；
第五，取鉴定为阳性重组质粒的大肠杆菌DH5ci，于LB液体培养基36°C~38°C培养12^18h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1-1L-8，即为基于鸭IL-8基因的禽流感疫苗免疫增强剂。
[0009]本发明的有益效果:本发明适用于鸭业养殖中各类疫苗的免疫增强剂，能够有效提高疫苗的使用效率，为鸭业养殖中免疫效率低下等提供技术支持。本发明与传统免疫增强剂相比，具有以下的技术优势和积极效果:
(I)增强效果明显:本发明所用真核表达质粒，能够特异性的刺激机体的免疫系统，对疫苗产生更好的免疫应答，与一般物理方法和生物方法相比，能够显著提高免疫效果(P〈0.05)，有效延长I周左右高抗体效价，且还能促进鸭群体重的增加，有效降低料肉比(Ρ〈0.05)。
[0010](2)制备简单:本发明在成功构建鸭PCDNA3.1-1L-8后，转入大肠杆菌DH5a中于_20°C保存，使用时只需将含有真核表达质粒的宿主菌DH5 α置于LB液体培养基中大量增殖12~16h，大量提取质粒后即可使用，与传统方法相比，制备周期短，耗费的人力物力较低。
[0011](3)使用方便:本发明所用真核表达质粒可直接在接种疫苗的同时，再注射
0.5mL~l.0mL的剂量，即可达到增强效果，且真核表达质粒不易降解，性能稳定。
[0012](4)成本低廉:本发明所用真核表达质粒易于增殖培养，且培养基配制方法简单，药品容易获得；同时对设备的要求不高，不用征地建厂或购买庞大设备，且不需特殊管理维护。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明的一种基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂的制备生产流程图。【具体实施方式】
[0014]本发明的实施例:鸭IL-8真核表达质粒的水溶液，以pcDNA3.1作为真核表达载体，其浓度为0.4mg/mL。
[0015]本发明的鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂的制备方法为:
第一，研磨新鲜的鸭内脏组织，包括肝、肾、脾等新鲜组织，采用RNA提取试剂盒提取鸭RNA，进行 RT-PCR ；
第二，将获得的目的基因片段连接于PMD-18T载体，构建pMD-18T-1L-8，再转入大肠杆菌DH5 α中；
第三，采用PCR方法从pMD-18T-1L-8扩增出IL-8基因，用Xho I + BamH I进行酶切，同法处理真核表达载体PCDNA3.1，然后电泳分离和分别回收目的基因；
第四，采用T4 DNA连接酶将鸭IL-8基因插入真核表达质粒pcDNA3.1中，转化大肠杆菌DH5 α，蓝白斑筛选，挑取可疑菌落于LB液体培养基于37°C培养16h，收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒，用PCR和双酶切鉴定；
第五，取鉴定为 阳性重组质粒的大肠杆菌DH5 α，于LB液体培养基37°C培养16h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1-1L-8，调整其浓度为0.4mg/mL,即为基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂。
[0016]第六，免疫增强剂的增强效果试验:取第五步获得的真核表达质粒，按每只鸭
0.5mL的剂量与禽流感疫苗同天不同部位注射，于第10d、24d、38d、52d和66d时抽血检测，免疫增强剂组在第38d、52d和66d的禽流感疫苗抗体效价比未注射免疫增强剂组差异极显著(Ρ〈0.01)。
[0017]第七，免疫增强剂的安全性检测:取第五步获得的真核表达质粒，按照0.25mL的剂量注射小鼠共30只，于第3d、10d、17d、24d和31d时观察小白鼠的临床表现，并在每个时间段剖杀3只观察内脏组织病变情况，小白鼠未表现明显的临床症状和病理变化，且未发生死亡，说明所制备的免疫增强剂具有良好的安全性。
[0018]通过以 上第一至第七步证实，发明的基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂获得成功。
【权利要求】
1.一种基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂，其特征在于:所述免疫增强剂为鸭IL-8真核表达质粒的水溶液，其浓度为0.4mg/mL"0.8mg/mL。
2.根据权利要求1所述的基于鸭IL-8真核表达质粒免疫增强剂，其特征在于:所述的鸭IL-8真核表达质粒含有鸭IL-8基因的编码序列，该基因的长度为312个核苷酸，类型为核苷酸，链性为单链，全长为编码区。
3.—种如权利要求1所述的一种基于鸭IL-8基因真核表达质粒的免疫增强剂的制备方法，其特征在于:它包括以下步骤: 第一，提取鸭RNA; 第二，将获得的目的基因片段连接于PMD-18T载体，构建pMD-18T-1L-8，再转入大肠杆菌DH5 α中； 第三，采用PCR方法从pMD-18T-1L-8扩增出IL-8基因，用Xho I + BamH I进行酶切，同法处理真核表达载体PCDNA3.1，然后电泳分离和分别回收目的基因； 第四，采用Τ4 DNA连接酶将鸭IL-8基因插入真核表达质粒pcDNA3.1中，转化大肠杆菌DH5a，蓝白斑筛选，挑取可疑菌落于LB液体培养基于36°C~38°C培养12~18h，收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒，用PCR和双酶切鉴定； 第五，取鉴定为阳性重组质粒的大肠杆菌DH5 a，于LB液体培养基36°C~38°C培养12^18h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1-1L-8，即为基于鸭IL-8基因的禽流感疫苗免疫增强 剂。
【文档编号】C12N15/85GK103990146SQ201410044865
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年2月7日 优先权日:2014年2月7日
【发明者】嵇辛勤, 阮涌, 文明, 傅心亮, 李世静 申请人:贵州大学