专利名称：一种动物用免疫增强剂的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物用免疫增强剂的制备方法及应用，属于兽医生物制品技术领域。
背景技术：
畜禽养殖业的迅猛发展，尤其是集约化饲养规模的日益扩大，使得疾病预防的问题愈加重要。疫苗接种是预防疾病的最基本、最有效的方法。但是由于各种原因，目前很多疫苗的免疫效果还不是十分理想，不能对动物提供完全的保护。为了提高疫苗的免疫效果，人们进行了大量的工作，如通过浓缩抗原提高抗原含量、提高抗原的免疫原性、优化制苗エ艺、采用优质佐剂、优化免疫程序等等来提高疫苗的免疫质量，通过使用免疫增效剂、減少各种有毒有害物质对免疫系统的伤害、提供良好的饲养条件、采用合理的用药程序来增强动物机体的免疫应答能力。其中，研究开发新型高效动物用免疫增强剂(佐剂)是提高免 疫效果的主要方法之一。佐剂又称免疫增强剂或免疫调节剂，是指先于抗原或与抗原同时注入动物体内，能非特异性改变或增强机体对该抗原的免疫应答的ー类物质。目前佐剂的品种较多，按照来源可分为无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油佐剂，如弗氏佐剂、矿物油佐剂等。上述佐剂中，有的虽然已经研究成功应用于人类如胸腺素和干扰素，但是价格较为昂贵，不可能用于动物。目前动物用疫苗所用佐剂主要还是以油佐剂、氢氧化铝铝胶佐剂为主，通过延长疫苗在注射部位的停留时间发挥佐剂效应，还没有直接通过增强动物机体自身的免疫应答能力的佐剂来提高免疫效果。草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)是分枝杆菌中的ー种，其中分枝杆菌胞壁酰ニ肽(MDP)具有很强的免疫治疗作用，草分枝杆菌多糖MPS在免疫调节、抑制病毒复制方面有很好效果(周莉婷，赵晶晶等，分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展，药物生物技木，2011. 18(2) :176-179)。经免疫学实验证明灭活的草分枝杆菌进入人体后，T淋巴细胞受到刺激,释放出多种淋巴因子,如IL-2、IL-4、TNF、IFN和MAF、MIF、MCF、MMF等，这些因子作用于单核-巨噬细胞系统，使之向病灶部位聚集、活化，对病原菌进行吞噬、杀伤和清除；同吋，自然杀伤(NK)细胞、B淋巴细胞也活化、增多，IgM、IgG増加或趋于正常，持久地介入机体的免疫过程，不断的调节细胞及体液免疫系统发挥免疫功能，从而增强机体免疫能力(陈孝治，乌体林斯注射液，中国新药杂志，2000，9 (9) =644-645)。草分枝杆菌是一种非致病性微生物，単独使用或与疫苗同时使用时没有毒性，通过提高宿主自身的免疫应答能力来提增强免疫力，安全可靠。草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，便于临床大面积推广使用
发明内容
本发明的目的是制备一种动物用免疫增强剂，一方面可以非特异性的提高动物的免疫能力，另一方面用其作为疫苗的佐剂成分，可以使动物用疫苗的免疫效果更确实，将动物疫苗免疫水平提高到一个新的高度，减少疾病发生，具有直接的经济效益和社会效益。使用本发明涉及的免疫增强剂能够1)增强动物免疫力，提高成活率和增重率；2)将动物用灭活疫苗的保护性抗体产生时间提前5 7天，使得动物免疫空白期更短，产生更好的免疫保护效果；本发明最关键的一点是，添加草分枝杆菌的禽流感灭活疫苗(H9亚型)，能使接种该疫苗的动物产生保护性抗体的时间提前5 7天。由于油乳剂灭活疫苗一般在免疫后10天开始产生抗体，14天血清中能检测到抗体，21 28天达到保护性水平，而肉鸡由于生长太快，免疫系统发育不完善，对抗原的免疫应答能力差，产生抗体更慢，抗体水平更低(马磊等，浅谈影响肉鸡免疫力下降的因素，家禽科学，2007，(11) :27-28)。草分枝杆菌动物用免疫增强剂使用后，肉鸡免疫后14天即可产生保护性抗体，大大缩小了免疫空白期，降低了养殖中疾病发生的风险。本发明中选用草分枝杆菌作为动物用疫苗佐剂，从调动机体免疫机能方面着手，增强了免疫效果，弥补了疫苗免疫中禽流感没有活疫苗做基础免疫的缺 憾，减少了整个养殖周期禽流感的发病率，具有直接的经济效益和社会效益。本发明主要技术方案在于本发明的一种动物用免疫增强剂，主要成分是草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)培养物的纯化制品；该动物用免疫增强剂主要是将草分枝杆菌发酵培养，通过灭活、浓缩、纯化、均质等工序制备而成；该一种动物用免疫增强剂的应用，可以单独使用，用于非特异性的增强动物机体免疫能力，其使用剂量为按照动物体重计算，每公斤体重注射草分枝杆菌菌体I 20mg ;该免疫增强剂可按照每毫升疫苗中添加0. 032 0. 8mg草分枝杆菌菌体的量添加到动物用灭活疫苗中混合均匀，按照疫苗的常规剂量进行免疫。
具体实施例方式I.菌株来源本发明涉及到的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)AS 4. 1180菌株购于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC AS 4. 1180(中国微生物菌种保藏管理委员会，中国菌种目录，1992版，机械工业出版社，1992，p285)。2.动物用免疫增强剂的制备方法动物用免疫增强剂的制备，是将编号为CGMCC AS 4. 1180草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)发酵培养,通过灭活、浓缩、纯化等工序制成草分枝杆菌菌体。具体制备步骤(I)种子培养将草分枝杆菌(Mycobacterium phlei) CGMCC AS 4. 1180株置于种子罐中进行培养，37°C通气培养，pH值为7. 0，培养时间为3 4天，得到发酵用种子液；种子罐中的培养基配方酵母提取粉Ig 5g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)2ml IOml,葡萄糖5g 50g,磷酸氢二铵Ig 4g,磷酸氢二钾0. 5g Ig,注射用水加至1000ml。(2)发酵培养为了得到活性最佳的草分枝杆菌，选择在细菌生长的对数期终止发酵，进行灭活，本发明对草分枝杆菌的培养时间进行了筛选试验。草分枝杆菌在液体培养基中培养72h后，每隔24h用血球计数板计数，在显微镜下测定细菌浓度，结果见下表I :表I草分枝杆菌的培养时间筛选试验
权利要求
1.一种动物用免疫增强剂，其特征在于该免疫增强剂主要成分是编号为AS 4. 1180的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)培养物的纯化制品,该草分枝杆菌购自北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国普通微生物保藏管理中心，编号=CGMCCAS 4. 1180。
2.权利要求I所述一种动物用免疫增强剂的制备方法，其特征是将编号为CGMCCAS4.1180草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)发酵培养,通过灭活、浓缩、纯化、均质等工序制备而成。
3.权利要求I所述一种动物用免疫增强剂的应用，其特征是可以单独使用，用于非特异性的增强动物机体免疫能力，其使用剂量为按照动物体重计算，每公斤体重注射草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)菌体 I 20mg。
4.权利要求I所述一种动物用免疫增强剂的应用，其特征是该免疫增强剂可按照每毫升疫苗中添加0. 032 0. 8mg草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)菌体的量添加到动物用灭活疫苗中混合均匀，按照疫苗的常规剂量进行免疫。
全文摘要
本发明涉及一种动物用免疫增强剂的制备方法及应用。本发明的技术方案为将草分枝杆菌发酵培养，通过灭活、浓缩、提纯、均质等工序制备成一种动物用免疫增强剂。可以单独使用，用于非特异性的增强动物的机体免疫能力，也可以作为动物用疫苗的佐剂成分使用。本发明所提供的方法，既能增强动物的机体免疫能力，提高动物的生产性能；又使疫苗的免疫效果更确实，具有直接的经济效益和社会效益。
文档编号A61P37/04GK102764434SQ201210057420
公开日2012年11月7日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者刘红娟, 张广, 徐龙涛, 李秀娟, 李金波, 王蕾, 鲍海忠 申请人:齐鲁动物保健品有限公司