专利名称：一种猪瘟活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪瘟活疫苗，尤其是一种含有适量灭活草分枝杆菌菌体的猪瘟活疫苗。
背景技术：
猪痕(Classicalswine fever, CSF)是由猪痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病。该病唯一的自然宿主是猪，是危害养猪业最严重的传染病之一，死亡率能够达到90%以上(殷震，刘景华，动物病毒学(第一版)fMl，北京，科学出版社，1997，652-653)。20世纪50年代，在各国研制出较为理想的灭活苗(Dalsgaard K, Overby E. Vaccination of pigs against hog cholera(classical swine fever)with a detergent split vaccine[J]. Acta Vet Scand. 1976,17 :465-474)的同时，我国学者周泰冲等研究的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒疫苗、日本的细胞弱毒疫苗、和法国的Thiverval 株等都获得成功并在猪瘟控制中起了得重要的作用。这三大品系疫苗的广泛应用，改变了全世界猪瘟防制的窘迫局面。目前，国内普遍使用的猪痕活疫苗是1954年培育出猪痕病毒兔化弱毒株(Hog Cholera Lapinized Virus, HCLV)制备而成的。该疫苗具有免疫力快、免疫谱宽、遗传稳定、无残毒、不引起胎儿畸变等优点。随着畜牧业的不断发展，对疫苗品质的要求也在不断提高，高效的猪瘟疫苗更是大势所趋。其中，使用免疫增强剂是一种常用的提高疫苗效力的方法。草分枝杆菌是分枝杆菌中的一种，由于分枝杆菌胞壁酰二肽(MDP)具有很强的免疫治疗作用，草分枝杆菌多糖MPS在免疫调节、抑制病毒复制方面有很好的效果(周莉婷、 赵晶晶等，分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展[J]，药物生物技术，2011，18 (2) :176-179)， 因而草分枝杆菌是一种优秀的免疫增强剂。草分枝杆菌可用于猪瘟活疫苗中，通过提高宿主自身的免疫应答能力来提增强疫苗免疫力，安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，便于临床大面积推广使用。草分枝杆菌菌体在添加到猪瘟活疫苗半成品之前需要灭活。由于普通的甲醛灭活剂有残留的风险，能对猪瘟病毒产生影响，我们考虑使用β -丙内酯对草分枝杆菌菌体进行灭活。由于β-丙内酯水溶液半衰期短(10°C时仅为18hr，25°C时为3. 5hr，50°C时为 20min，75°C时为5min)，能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，灭活的草分枝杆菌菌体中无灭活剂残留，能够有效保护猪瘟病毒的免疫原性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种更加高效的猪瘟活疫苗，从而在将猪瘟活疫苗的免疫水平提高到一个新的高度，更加有效的预防免疫猪群猪瘟的发生。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为
将编号为CGMCC AS 4. 1180的草分枝杆菌菌株，制备成草分枝杆菌菌体；按常规方法用猪痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成兔源抗原后，按每头份疫苗中含O. 01 O. lmg，优选量为O. 06mg加入草分枝杆菌草分枝杆菌(CGMCC AS 4. 1180菌株)菌体后，再经过混匀、冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(兔源)；按常规方法用猪瘟病毒兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成细胞源抗原后，按每头份疫苗中含O. 01 O. lmg，优选量为O. 06mg加入草分枝杆菌菌体后，再经过混匀、冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(细胞源)。
具体实施例方式I.草分枝杆菌菌株来源本发明涉及到的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4. 1180菌株购于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国普通微生物保藏管理中心，编号CGMCC AS 4. 1180(中国微生物菌种保藏管理委员会，中国菌种目录，机械工业出版社，1992，p285)。2.草分枝杆菌菌体的制备(I)种子培养将草分枝杆菌CGMCC AS 4. 1180株置于种子罐中进行培养，37°C通气培养，pH值为7. 0，培养时间为3 4天，得到发酵用种子液；种子罐中的培养基配方酵母提取粉I. Og 5. 0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)2. Og 10. Og,葡萄糖5. Og 50g,磷酸氢二铵I. Og 4. Og,磷酸氢二钾
O.5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo(2)草分枝杆菌发酵培养将配制好的液体培养基与所培养的种子液一起放入种子罐进行发酵培养，37°C通气培养，pH值为7.0，培养时间为5天；发酵罐中培养基配方酵母提取粉5. Og 10. 0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)5. Og 20g,葡萄糖20g IOOg,磷酸氢二铵I. Og 4. Og,磷酸氢二钾
O.5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo⑶后处理将发酵液用的β -丙内酯(V/V终浓度为1/5000 1/3000，优选1/4000)灭活， 4°C灭活24h，然后再于37°C水解2h，离心浓缩，弃去上清液，取下层菌体用适量生理盐水重悬浮3次，离心除去杂质，测定水分，计算干菌体重量，即得灭活的草分枝杆菌菌体。3.猪瘟活疫苗的制备本发明的猪瘟活疫苗用的毒种为猪瘟病毒兔化弱毒株，购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，编号为CVCC AV1412(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社，2002， pl45)。(I)半成品制备工艺一
I)生产用毒种的制备(兔源脾毒)选择营养良好的家兔，将冻干的猪瘟兔化弱毒株毒种用灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1ml。选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀。无菌采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。2)制苗用病毒的制备①将生产用毒种用无菌生理盐水稀释50倍后每兔耳静脉注射1ml。②选定定型热和轻热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采取脾脏和淋巴结，得到高效猪瘟活疫苗半成品，立即配苗或迅速冻结保存后配苗。工艺二I)生产用毒种的制备(细胞毒)用细胞维持液将脾毒制成O. 3% O. 5%的病毒悬液，接种生长良好的牛睾丸或羊肾单层细胞，置36 37°C继续培养。每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。2)细胞的制备①无菌采取牛睾丸，并去除被膜、附睾、肾盂、肾盖，将组织剪成I 2mm小块，用 Hank’ s液冲洗至上清液清亮。②将组织块放入消化瓶中，加入5 8倍的O. 25%胰酶溶液，37°C水浴消化。③弃去胰酶溶液后，脱酶I 3次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法分散细胞后，用纱布滤过，收取细胞悬液，分装于培养瓶中，置36 37°C进行旋转培养，转速为10 12r/ h,3 5日长成单层。④原代细胞长成单层后，以(I : 3) (I : 5)制成次代细胞悬液，继续旋转培养至形成良好单层。3)制苗毒液的制备①取形成良好单层的牛睾丸次代细胞，弃去培养液，接种含3% 5%生产用细胞毒种，置36 37 °C继续培养。②接毒后5日做第一次收获换液，以后每隔4日收获换液I次，得半成品，置于-15°C以下保存。(2)配苗按照每头份疫苗加入O. 01 O. Img (优选O. 06mg)菌体的量，在猪瘟活疫苗半成品中加入草分枝杆菌菌体，并且按照比例加入5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂或其他冻干保护剂， 搅拌均匀后分装，最后进行冷冻真空干燥，根据抗原的不同分别制成猪瘟活疫苗(兔源)和猪瘟活疫苗(细胞源)。4.对比试验(I)分别制备不添加草分枝杆菌菌体的猪瘟活疫苗(细胞源)、猪瘟活疫苗(兔源)和每头份添加O. 06mg草分枝杆菌菌体的猪瘟活疫苗(细胞源)、猪瘟活疫苗(兔源)，备用。(2)取四种猪瘟活疫苗，用生理盐水稀释成I头份/ml，分别肌肉注射无猪瘟中和抗体的猪20头。
(3)免疫后15日采集免疫猪血清，采用阻断ELISA方法检测猪瘟抗体水平。(4)诊断试剂猪瘟抗体ELISA试剂盒为法国LSI猪瘟抗体检测试剂盒，购自北京天之泰生物科技有限公司，生产批号为5-VETPPC-002。(5)判定标准阻断率30阴性；< 40而> 30为可疑；> 40为阳性。(6)试验结果
权利要求
1.一种猪痕活疫苗,其特征是该疫苗含有猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)和灭活的草分枝杆菌菌体。
2.一种如权利要求I所述一种猪瘟活疫苗，其特征在于其中灭活的草分枝杆菌菌体是利用草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4. 1180菌株发酵培养后，使用β-丙内酯进行灭活的产物。
3.一种制备权利要求I所述的猪瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常规方法用猪瘟病毒(Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成兔源抗原后，按每头份疫苗中含O. 01 O. lmg，优选量为O. 06mg加入灭活的草分枝杆菌菌体，再经过混匀、 冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(兔源)。
4.一种权利要求I所述的猪瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常规方法用猪瘟病毒 (Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成细胞源抗原后,按每头份疫苗中含O. 01 O. lmg，优选量为O. 06mg加入灭活的草分枝杆菌菌体后，再经过冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(细胞源)。
全文摘要
本发明涉及一种猪瘟活疫苗及其生产方法。该疫苗是在普通商品化猪瘟活疫苗中加入了适量的草分枝杆菌菌体，注射后通过提高宿主自身的免疫应答能力，并与猪瘟病毒兔化弱毒株抗原协同作用，达到增强疫苗免疫力的作用，安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，可应用于高效猪瘟活疫苗的生产中。本发明提高了猪瘟活疫苗的免疫效果，能够更加有效的预防猪瘟的发生，具有直接的经济效益和社会效益。
文档编号A61P31/14GK102600469SQ20121005730
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者刘红娟, 吴昊, 徐龙涛, 王蕾, 鲍海忠 申请人:齐鲁动物保健品有限公司