专利名称：一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液，尤其是ー种含有适量灭活草分枝杆菌菌体的高致病性猪繁埴与呼吸综合征活疫苗稀释液。
背景技术：
猪繁通与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称“猪蓝耳病”，是由猪繁埴与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪的ー种高度接触性传染病,不同年龄、品种和性别的猪均能感染，但以妊娠母猪和I月龄以内的仔猪最易感；该病以母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及仔猪咳嗽、气喘等呼吸症状为主要特征。该病从20世纪80年代后期出现以来，已给全球的养猪业造成严重的经济损失。(吴佳俊等，猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗研究进展，中国预防兽医学报，2010，32 (8) =655-658)。
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2006年4月，我国南方地区暴发了ー种以持续高热、食欲废绝、身体发绀、蓝耳、腹泻为特征，高发病率和高死亡率，传播迅速的高致病性蓝耳病(Highly pathogenic PRRS,HP-PRRS)，波及全国25个省份，经济损失巨大，研究证明引发该病的主要病原是高致病性PRRSV，鉴于该病的严重危害性，我国于2008年底在新修订的《一、ニ、三类动物疫病病种名录》中将其列为ー类动物疫病(韦天超，2009)。高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又名蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株(PRRSV)引起猪的ー种急性、热性、接触性传染病。以繁殖障碍、呼吸困难、耳朵蓝紫、并发其他传染病为主要特征。(马红艳，郝永清，猪繁殖与呼吸综合征的研究.畜牧与饲料科学，2007，28 (4) :43-45.)。为了有效地控制高致病性猪繁殖与呼吸综合征，国内已开发用于预防PRRS的疫苗。在PRRS活疫苗研制中，疫苗毒株、病毒培养条件和免疫增强剂是研发有效疫苗的关键。其中，添加免疫增强剂是提高疫苗效力的有效途径。草分枝杆菌是分枝杆菌中的ー种，其中分枝杆菌胞壁酰ニ肽(MDP)具有很强的免疫治疗作用，草分枝杆菌多糖MPS在免疫调节、抑制病毒复制方面有很好效果(周莉婷，赵晶晶等，分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展，药物生物技术，2011，18 (2) =176-179)。草分枝杆菌可用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液中，通过提高宿主自身的免疫应答能力来提增强疫苗免疫力，安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，便于临床大面积推广使用。由于稀释液需要与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗混合使用，普通的甲醛灭活剂在草分枝杆菌菌体中有残留的风险，能对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒产生影响，我们考虑使用丙内酯对草分枝杆菌菌体进行灭活。由于丙内酯水溶液半衰期短(10°C时仅为18hr，25°C时为3. 5hr，50°C时为20min，75°C时为5min)，能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，灭活的草分枝杆菌菌体中无灭活剂残留，能够有效保护高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的免疫原性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液，从而将高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的免疫水平提高到一个新的高度，更加有效的预防免疫猪群高致病性猪繁殖与呼吸综合征的发生。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为利用一株购于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国普通微生物保藏管理中心、编号为CGMCC AS 4. 1180的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)编号CGMCC AS 4. 1180菌株，进行草分枝杆菌菌体的制备，然后将草分枝杆菌菌体按照每毫升中含O. 001 O. Img菌体(优选O. 08mg)的量添加到高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液中，得到ー种新型疫苗稀释液。
具体实施例方式I.草分枝杆菌菌株来源本发明涉及到的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)菌株购于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国普通微生物保藏管理中心，编号=CGMCC AS
4.1180。2.草分枝杆菌菌体的制备(I)种子培养将草分枝杆菌(Mycobacterium phlei) CGMCC AS 4. 1180株置于种子耀中进行培养，37°C通气培养，pH值为7. 0，培养时间为3 4天，得到发酵用种子液；种子罐中的培养基配方酵母提取粉I. Og 5. 0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)2. Og 10. Og,葡萄糖5. Og 50g,磷酸氢ニ铵I. Og 4. Og,磷酸氢ニ钾O. 5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo(2)草分枝杆菌发酵培养将配制好的液体培养基与所培养的种子液一起放入种子罐进行发酵培养，37°C通气培养，pH值为7.0，培养时间为5天；发酵罐中培养基配方酵母提取粉5. Og 10. 0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)5. Og 20g,葡萄糖20g IOOg,磷酸氢ニ铵I. Og 4. Og,磷酸氢ニ钾0. 5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo⑶后处理将发酵液用β丙内酯(1/4000)灭活后，离心浓缩，弃去上清液，取下层菌体用适量生理盐水重悬浮3次，离心除去杂质，測定水分，计算干菌体重量，即得草分枝杆菌菌体。3.高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液的制备(I)磷酸缓冲液疫苗稀释液制备I)磷酸缓冲液的配制甲液磷酸ニ氢钾9. 074g、注射用水加至1000ml ；乙液:磷酸氢ニ钠9. 465g、注射用水加至1000ml。如果用含结晶水的磷酸盐，则称量时要按带水的克分子量除以15称量。按照甲液こ液=19ml 81ml 37ml 63ml的比例进行磷酸缓冲液的配制，得磷酸缓冲液。2)疫苗稀释液的制备在配制好的磷酸缓冲液中加入草分枝杆菌菌体，加量为O. 01 O. lmg/ml (优选O. 08mg/ml)，即得磷酸缓冲液疫苗稀释液。(2)生理盐水稀释液制备 在O. 9 % NaCl溶液中，加入草分枝杆菌菌体，加量为O. 01 O. lmg/ml (优选O. 08mg/ml)，即得生理盐水疫苗稀释液。4.对比试验(I)取商品化的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，分别用磷酸缓冲液疫苗稀 释液、生理盐水疫苗稀释液和加入O. 08mg/ml草分枝杆菌菌体的磷酸缓冲液疫苗稀释液、生理盐水疫苗稀释液进行稀释至I头份/ml，备用。(2)将稀释好的四种疫苗，分别肌肉注射20头4-6周龄健康易感仔猪，Iml/头。(3)免疫28日后，分离血清用猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒(ELISA)检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平。(4)检测试剂猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA试剂盒为美国IDEXX抗体检测试剂盒，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司，生产批号为09418-KE158。(5)抗体检测方法采用猪蓝耳病病毒N蛋白的基因工程表达产物包被微孔板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪蓝耳病N蛋白的特异性抗体，则将与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标ニ抗，与包被板上抗原抗体复合物发生特异性结合再经洗涤除去未结合酶结合物，在孔中加入TMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液終止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD值。(6)判定标准在酶标仪上测各孔OD63tol值，样品OD63tlnm值> O. 42，判为阳性；样品OD63tlnm值介于
O.387 O. 42之间，判为可疑；样品OD63tlnm值< O. 38，判为阴性。(7)试验结果
权利要求
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液，其特征是每毫升稀释液含有O. Ol O. 2mg、优选 O. 08mg 灭活的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei) CGMCC AS 4.1180菌体和磷酸缓冲液。
2.如权利要求I所述的ー种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液，其特征是其中 的磷酸缓冲液可以用生理盐水替代。
全文摘要
本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液。该高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液中加入了适量的草分枝杆菌菌体，注射后通过提高宿主自身的免疫应答能力，并与高致病性蓝耳病毒抗原协同作用，可达到增强疫苗免疫力的作用，从而增加疫苗的免疫效果，能够更加有效的预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征的发生；使用安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，可大面积应用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释液的生产中，具有直接的经济效益和社会效益。
文档编号A61P37/04GK102716482SQ20121005712
公开日2012年10月10日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者刘红娟, 吴昊, 徐龙涛, 王蕾, 鲍海忠 申请人:齐鲁动物保健品有限公司